Abstract Eukaryotic cells express a wide variety of endogenous small regulatory RNAs that function in the nucleus. We previously found that erroneous rRNAs induce the generation of antisense ribosomal siRNAs (risiRNAs) which silence the expression of rRNAs via the nuclear RNAi defective (Nrde) pathway. To further understand the biological roles and mechanisms of this class of small regulatory RNAs, we conducted forward genetic screening to identify factors involved in risiRNA generation in Caenorhabditis elegans . We found that risiRNAs accumulated in the RNA exosome mutants. risiRNAs directed a NRDE-dependent silencing of pre-rRNAs in the nucleolus. In the presence of risiRNA, NRDE-2 accumulated in the nucleolus and colocalized with RNA polymerase I. risiRNA inhibited the transcription elongation of RNA polymerase I by decreasing RNAP I occupancy downstream of the site of RNAi. Meanwhile, exosome mislocalized from the nucleolus to nucleoplasm in suppressor of siRNA (susi) mutants, in which erroneous rRNAs accumulated. These results establish a novel model of rRNA surveillance by combining ribonuclease-mediated RNA degradation with small RNA-directed nucleolar RNAi system.

Abstract Environmental stimuli not only alter gene expression profiles but also induce structural changes in cells. How distinct nuclear bodies respond to cellular stress is poorly understood. Here, we identified a new subnuclear organelle named the nucleolar stress body (NoSB), the formation of which was induced by the inhibition of rRNA transcription or inactivation of rRNA processing and maturation in C. elegans . NoSB did not colocalize with other previously described subnuclear organelles. We conducted forward genetic screening and identified a new bZIP transcription factor, named n ucle o lar s tress response-1 (NOSR-1), that is required for NoSB formation. The inhibition of rRNA transcription or inactivation of rRNA processing and maturation increased nosr-1 expression. By using transcriptome analysis of wild-type animals subjected to different nucleolar stress conditions and nosr-1 mutants, we identified that the SR-like protein NUMR-1 (nuclear localized metal responsive) is the target of NOSR-1. Interestingly, NUMR-1 is a component of NoSB and itself per se is required for the formation of NoSB. We concluded that the NOSR-1/NUMR-1 axis likely responds to nucleolar stress and mediates downstream stress-responsive transcription programs and subnuclear morphology alterations in C. elegans .

Germ granules are biomolecular condensates present in most animal germ cells. One function of germ granules is to help maintain germ cell totipotency by organizing mRNA regulatory machinery, including small RNA-based gene regulatory pathways. The C. elegans germ granule is compartmentalized into multiple subcompartments whose biological functions are largely unknown. Here, we identify an uncharted subcompartment of the C. elegans germ granule, which we term the E granule. The E granule is nonrandomly positioned within the germ granule. We identify five proteins that localize to the E granule, including the RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) EGO-1, the Dicer-related helicase DRH-3, the Tudor domain-containing protein EKL-1, and two intrinsically disordered proteins, EGC-1 and ELLI-1. Localization of EGO-1 to the E granule enables synthesis of a specialized class of 22G RNAs, which derive exclusively from 5' regions of a subset of germline-expressed mRNAs. Defects in E granule assembly elicit disordered production of endogenous siRNAs, which disturbs fertility and the RNAi response. Our results define a distinct subcompartment of the C. elegans germ granule and suggest that one function of germ granule compartmentalization is to facilitate the localized production of specialized classes of small regulatory RNAs.

Abstract Germ granules are biomolecular condensates present in most animal germ cells. One function of germ granules is to help maintain germ cell totipotency by organizing mRNA regulatory machinery, including small RNA-based gene regulatory pathways. The C. elegans germ granule is compartmentalized into multiple subcompartments whose biological functions are largely unknown. Here, we identify a new subcompartment of the C. elegans germ granule, which we term the E compartment. The E compartment is nonrandomly positioned within the germ granule. We identified five proteins that localize to the E compartment, including the RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) EGO-1, the Dicer-related helicase DRH-3, the Tudor domain-containing protein EKL-1, and two intrinsically disordered proteins, EGC-1 and ELLI-1. Localization of EGO-1 to the E granule enables synthesis of a specialized class of 22G RNAs, which derive exclusively from 5 ’ regions of a subset of germline-expressed mRNAs. Defects in E compartment assembly elicit disordered production of endogenous siRNAs, which disturbs fertility and the RNAi response. Our results define a new subcompartment of the C. elegans germ granule and suggest that one function of germ granule compartmentalization is to facilitate the localized production of specialized classes of small regulatory RNAs.

ABSTRACT The chromatin organization modifier domain (chromodomain) is an evolutionally conserved motif across eukaryotic species. The chromodomain mainly functions as a histone methyl-lysine reader to modulate gene expression, chromatin spatial conformation and genome stability. Mutations or aberrant expression of chromodomain proteins can result in cancer and other human diseases. Here, we systematically tagged chromodomain proteins with green fluorescent protein (GFP) using CRISPR/Cas9 technology in C. elegans . By combining ChIP-seq analysis and imaging, we delineated a comprehensive expression and functional map of chromodomain proteins. We then conducted a candidate-based RNAi screening and identified factors that regulate the expression and subcellular localization of the chromodomain proteins. Specifically, we revealed a new H3K9me1/2 reader, CEC-5, both by in vitro biochemistry and in vivo ChIP assays. MET-2, an H3K9me1/2 writer, is required for CEC-5 association with heterochromatin. Both MET-2 and CEC-5 are required for the normal lifespan of C. elegans . Furthermore, a forward genetic screening identified a conserved Arginine124 of CEC-5’s chromodomain, which was essential for CEC-5’s association with chromatin and life span regulation. Thus, our work will serve as a reference to explore chromodomain functions and regulation in C. elegans and allow potential applications in aging-related human diseases.

Abstract Temperature greatly affects numerous biological processes in all organisms. How multicellular organisms respond to and are impacted by hypothermic stress remains elusive. Here, we found that cold-warm stimuli induced depletion of the RNA exosome complex in the nucleoli but enriched it in the nucleoplasm. To further understand the function and mechanism of cold-warm stimuli, we conducted forward genetic screening and identified ZTF-7, which is required for RNA exosome depletion from nucleoli upon transient cold-warm exposure in C. elegans . ZTF-7 is a putative ortholog of human ZNF277 that may contribute to language impairments. Immunoprecipitation followed by mass spectrometry (IP-MS) found that ZTF-7 interacted with RPS-2, which is a ribosomal protein of the small subunit and participates in pre-rRNA processing. A partial depletion of RPS-2 and other proteins of the small ribosomal subunit blocked the cold-warm stimuli-induced reduction of exosome subunits from the nucleoli. These results established a novel mechanism by which C. elegans responds to environmental cold-warm exposure.

PIWI-interacting RNAs (piRNAs) are essential for maintaining genome integrity and fertility in various organisms. In flies and nematodes, piRNA genes are encoded in heterochromatinized genomic clusters. The molecular mechanisms of piRNA transcription remain intriguing. Through unique molecular indexed-small RNA sequencing and chromosome editing, we discovered that spatial aggregation of piRNA genes enhances their transcription in nematodes. The heterochromatinized piRNA genome recruits the piRNA transcription complex USTC (including PRDE-1, SNPC-4, TOFU-4, and TOFU-5) and the H3K27me3 reader UAD-2, which phase separate into droplets to initiate piRNA transcription. We searched for factors that regulate piRNA condensate formation and isolated the SUMO E3 ligase GEI-17 as inhibiting and the SUMO protease TOFU-3 as promoting condensate formation, thereby regulating piRNA production. Our study revealed that spatial aggregation of piRNA genes, phase separation and deSUMOylation may benefit the organization of functional biomolecular condensates to direct piRNA transcription in the heterochromatinized genome.

Abstract The nucleolus is the most prominent membraneless organelle within the nucleus and plays essential roles in rRNA transcription and processing and ribosome assembly. How the structure of the nucleolus is maintained and regulated is poorly understood. Here, we identified two types of nucleoli in C. elegans . Type I nucleoli are spherical, and rRNA transcription and processing factors are evenly distributed throughout the nucleolus. In type II nucleoli, rRNA transcription and processing factors exclusively accumulate in the periphery rim, which is named the nucleolar ring. The hollow vacuole inside the nucleolar ring contains proteins that usually localize in the nucleoplasm but are capable of exchanging contents across the ring. The high-order structure of the nucleolus is dynamically regulated in C. elegans . Faithful rRNA processing is important to maintain the spherical structure of the nucleoli. The depletion of a class of rRNA processing factors, for example, class I ribosomal proteins of the large subunit (RPL), which are involved in 27SA 2 rRNA processing, reshaped spherical nucleoli to a ring-shaped nucleolar structure. The inhibition of RNAP I transcription and depletion of two conserved nucleolar factors, nucleolin and fibrillarin, prohibits the formation of the nucleolar ring. We concluded that the integrity of nucleoli is highly dependent on rRNA processing and maturation, which may provide a mechanism to coordinate structure maintenance and gene expression.

Abstract Histone methylation plays crucial roles in the development, gene regulation and maintenance of stem cell pluripotency in mammals. Recent work shows that histone methylation is associated with aging, yet the underlying mechanism remains unclear. In this work, we identified a class of histone 3 lysine 9 mono-/dimethyltransferase genes ( met-2, set-6, set-19, set-20, set-21, set-32 and set-33 ), mutations in which induce synergistic lifespan extension in the long-lived DAF-2 (IGF-1 receptor) mutant in C. elegans . These histone methyltransferase plus daf-2 double mutants not only exhibited an average lifespan nearly three times that of wild-type animals and a maximal lifespan of approximately 100 days, but also significantly increased resistance to oxidative and heat stress. Synergistic lifespan extension depends on the transcription factor DAF-16 (FOXO). mRNA-seq experiments revealed that the mRNA levels of class I DAF-16 target genes, which are activated by DAF-16, were further elevated in the double mutants. Among these genes, F35E8.7, nhr-62, sod-3, asm-2 and Y39G8B.7 are required for the lifespan extension of the daf-2;set-21 double mutant. In addition, treating daf-2 animals with the H3K9me1/2 methyltransferase G9a inhibitor also extends lifespan and increases stress resistance. Therefore, investigation of DAF-2 and H3K9me1/2 methyltransferase deficiency-mediated synergistic longevity will contribute to a better understanding of the molecular mechanisms of aging and therapeutic applications.

Pairing center (PC) on each chromosome of Caenorhabditis elegans is crucial for homolog pairing and initiating synapsis. Within each PC, clusters of 11/12 bp DNA motif recruit one of four paralogous meiosis-specific proteins: ZIM-1, ZIM-2, ZIM-3, or HIM-8. However, the mechanistic basis underlying the specificity of ZIM/HIM-8-PC DNA interaction remains elusive. Here, we describe crystal structures of HIM-8, ZIM-1 and ZIM-2 DNA binding domains (ZF1, ZF2 and CTD) in complex with their cognate PC DNA motifs, respectively. These structures demonstrated the ZF1-2-CTD folds as an integrated structural unit crucial for its DNA binding specificity. Base-specific DNA-contacting residues are exclusively distributed on ZF1-2 and highly conserved. Furthermore, the CTD potentially contributes to the conformational diversity of ZF1-2, imparting binding specificity to distinct PC DNA motifs. These findings shed light on the mechanism governing PC DNA motif recognition by ZIM/HIM-8 proteins, suggesting a co-evolution relationship between PC DNA motifs and ZF1-2-CTD in shaping the specific recognition. Pairing center (PC) on each chromosome are crucial for homolog pairing and initiating synapsis in Caenorhabditis elegans. Here the authors investigate how the meiosis-specific proteins: ZIM/HIM-8 family recognize their cognate PC DNA motifs.