Abstract Timing the acquisition of a beneficial microbe relative to the evolutionary history of its host can shed light on the adaptive impact of a partnership. Here, we investigated the onset and molecular evolution of an obligate symbiosis between Cassidinae leaf beetles and Candidatus Stammera capleta, a γ-proteobacterium. Residing extracellularly within foregut symbiotic organs, Stammera upgrades the digestive physiology of its host by supplementing plant cell wall-degrading enzymes. We observe that Stammera is a shared symbiont across tortoise and hispine beetles that collectively comprise the Cassidinae subfamily, despite differences in their folivorous habits. In contrast to its transcriptional profile during vertical transmission, Stammera elevates the expression of genes encoding digestive enzymes while in the foregut symbiotic organs, matching the nutritional requirements of its host. Symbiont acquisition during the Paleocene (∼62 Mya) did not coincide with the origin of Cassidinae beetles, despite the widespread distribution of Stammera across the subfamily. Early-diverging lineages lack the symbiont and the specialized organs that house it. Reconstructing the ancestral state of host-beneficial factors revealed that Stammera encoded three digestive enzymes at the onset of symbiosis, including polygalacturonase – a pectinase that is universally shared. While non-symbiotic cassidines encode polygalacturonase endogenously, their repertoire of plant cell wall-degrading enzymes is more limited compared to symbiotic beetles supplemented with digestive enzymes from Stammera . Highlighting the potential impact of a symbiotic condition and an upgraded metabolic potential, Stammera -harboring beetles exploit a greater variety of plants and are more speciose compared to non-symbiotic members of the Cassidinae.

Abstract Insects typically acquire their beneficial microbes early in development. Endosymbionts housed intracellularly are commonly integrated during oogenesis or embryogenesis, whereas extracellular microbes are only known to be acquired after hatching by immature instars such as larvae or nymphs. Here, however, we report on an extracellular symbiont that colonises its host during embryo development. Tortoise leaf beetles (Chrysomelidae: Cassidinae) host their digestive bacterial symbiont Stammera extracellularly within foregut symbiotic organs, and in ovary-associated glands to ensure its vertical transmission. We outline the initial stages of symbiont colonization and observe that while the foregut symbiotic organs develop three days prior to larval emergence, they remain empty until the final 24 hours of embryo development. Infection by Stammera occurs during that timeframe, and prior to hatching. By experimentally manipulating symbiont availability to embryos in the egg, we describe a 12-hour developmental window governing colonization by Stammera . Symbiotic organs form normally in aposymbiotic larvae, demonstrating that these Stammera -bearing structures develop autonomously. In adults, the foregut symbiotic organs are already colonized following metamorphosis and host a stable Stammera population to facilitate folivory. The ovary-associated glands, however, initially lack Stammera . Symbiont abundance subsequently increases within these transmission organs, thereby ensuring sufficient titers at the onset of oviposition ∼29 days following metamorphosis. Collectively, our findings reveal that Stammera colonization precedes larval emergence, where its proliferation is eventually decoupled in adult beetles to match the nutritional and reproductive requirements of its host.

The metabolic intimacy of symbiosis often demands the work of specialists. Natural products and defensive secondary metabolites can drive specificity by ensuring infection and propagation across host generations. But in contrast to bacteria, little is known about the diversity and distribution of natural product biosynthetic pathways among fungi and how they evolve to facilitate symbiosis and adaptation to their host environment. In this study, we define the secondary metabolism of Escovopsis and closely related genera, members of which are specialized, diverse ascomycete fungi best known as mycoparasites of the fungal cultivars grown by fungus-growing ants. We ask how the gain and loss of various biosynthetic pathways corresponds to divergent lifestyles. Long-read sequencing allowed us to define the chromosomal features of representative Escovopsis strains, revealing highly reduced genomes (21.4-38.3 Mb) composed of 7-8 chromosomes. Escovopsis genomes are highly co-linear, with genes localizing not only in the same chromosome, but also in the same order. Macrosynteny is high within Escovopsis clades, and decreases with increasing phylogenetic distance, while maintaining a high degree of mesosynteny. To explore the evolutionary history of biosynthetic pathways in this group of symbionts relative to their encoding lineages, we performed an ancestral state reconstruction analysis, which revealed that, while many secondary metabolites are shared with non-ant associated sordariomycetes, 56 pathways are unique to the symbiotic genera. Reflecting adaptation to diverging ant agricultural systems, we observe that the stepwise acquisition of these pathways mirrors the ecological radiations of attine ants and the dynamic recruitment and replacement of their fungal cultivars. As different clades encode characteristic combinations of biosynthetic gene clusters, these delineating profiles provide important insights into the possible mechanisms underlying specificity between these symbionts and their hosts. Collectively, our findings shed light on the evolutionary dynamic nature of secondary metabolism in Escovopsis and its allies, reflecting adaptation of the symbionts to an ancient agricultural system.

The pine weevil (Hylobius abietis), a major pest of conifer forests throughout Europe, feeds on the bark and cambium, tissues rich in terpenoid resins that are toxic to many insect herbivores. Here we report the ability of the pine weevil gut microbiota to degrade the diterpene acids of Norway spruce. The diterpene acid levels present in ingested bark were substantially reduced on passage through the pine weevil gut. This reduction was significantly less upon antibiotic treatment, and supplementing the diet with gut suspensions from untreated insects restored the ability to degrade diterpenes. In addition, cultured bacteria isolated from pine weevil guts were shown to degrade a Norway spruce diterpene acid. In a metagenomic survey of the insect′s bacterial community, we were able to annotate several genes of a previously described diterpene degradation (dit) gene cluster. Antibiotic treatment disrupted the core bacterial community of H. abietis guts and eliminated nearly all dit-genes concordant with its reduction of diterpene degradation. Pine weevils reared on an artificial diet spiked with diterpenes, but without antibiotics, were found to lay more eggs with a higher hatching rate than weevils raised on diets with antibiotics or without diterpenes. These results suggest that gut symbionts contribute towards host fitness, but not by detoxification of diterpenes, since these compounds do not show toxic effects with or without antibiotics. Rather the ability to thrive in a terpene rich environment appears to allow gut microbes to benefit the weevil in other ways, such as increasing the nutritional properties of their diet.