Rituximab (RTX) plus chemotherapy (R-CHOP) applied as a first-line therapy for lymphoma leads to a relapse in approximately 40% of the patients. Therefore, novel approaches to treat aggressive lymphomas are being intensively investigated. Several RTX-resistant (RR) cell lines have been established as surrogate models to study resistance to R-CHOP. Our study reveals that RR cells are characterized by a major downregulation of CD37, a molecule currently explored as a target for immunotherapy. Using CD20 knockout (KO) cell lines, we demonstrate that CD20 and CD37 form a complex, and hypothesize that the presence of CD20 stabilizes CD37 in the cell membrane. Consequently, we observe a diminished cytotoxicity of anti-CD37 monoclonal antibody (mAb) in complement-dependent cytotoxicity in both RR and CD20 KO cells that can be partially restored upon lysosome inhibition. On the other hand, the internalization rate of anti-CD37 mAb in CD20 KO cells is increased when compared to controls, suggesting unhampered efficacy of antibody drug conjugates (ADCs). Importantly, even a major downregulation in CD37 levels does not hamper the efficacy of CD37-directed chimeric antigen receptor (CAR) T cells. In summary, we present here a novel mechanism of CD37 regulation with further implications for the use of anti-CD37 immunotherapies.

Rituximab (RTX) plus chemotherapy (R-CHOP) applied as a first-line therapy for lymphoma leads to a relapse in approximately 40% of patients. Therefore, novel approaches to treat aggressive lymphomas are being intensively investigated. Several RTX-resistant (RR) cell lines have been established as surrogate models to study resistance to R-CHOP. Our study reveals that RR cells are characterized with a major downregulation of CD37, a molecule currently explored as a target for immunotherapy. Using CD20 knockout (KO) cell lines, we demonstrate for the first time that CD20 and CD37 form a complex and the presence of CD20 stabilizes CD37 in the cell membrane. Consequently, we observe a diminished cytotoxicity of anti-CD37 monoclonal antibody (mAb) in complement-dependent cytotoxicity in both RR and CD20 KO cells that can be partially restored upon lysosome inhibition. On the other hand, the internalization rate of anti-CD37 mAb in CD20 KO cells is increased when compared to controls, suggesting unhampered efficacy of antibody drug conjugates. Importantly, even a major downregulation in CD37 levels does not hamper the efficacy of CD37-directed chimeric antigen receptor (CAR) T cells. In summary, we present here a novel mechanism of CD37 regulation with further implications for the use of anti-CD37 immunotherapies.

Abstract Immunotherapy revolutionized cancer treatment in the last decade. Natural killer (NK) cells are one of the key host immunity components against malignant cells. Thus, they are currently extensively investigated in the field of immunotherapy of cancer. Different approaches have been developed to improve the antitumor activity of NK cells. Nonetheless, tumor microenvironment remains an obstacle to effective NK cell-based therapies. Here, we demonstrated that a cancer-conditioned medium suppresses the anti-tumor activity of NK cells. Further, we found that ammonia, a by-product of cancer cell metabolism, accumulates in the cancer-conditioned medium and tumor microenvironment. We identified that ammonia impairs the cytotoxicity of NK cells as well as the effectiveness of antibody-based and chimeric antigen receptor (CAR)-NK-based therapies in vitro . Inhibited activity of NK cells was caused by decreased levels of perforin. This effect was dependent on the lysosomotropic features of ammonia and its ability to increase pH in acidic compartments. In consequence, upon contact with ammonia the mature form of perforin was decreased in NK cells leading to their dysfunction. Our findings demonstrate that in addition to its previously described role of promoting tumor growth as a nitrogen source for tumor biomass ammonia could promote tumor escape as an NK cells immune checkpoint. Graphical abstract Highlights Cancer-conditioned medium suppresses the antitumor activity of NK cells Ammonia accumulates in conditioned medium and in the tumor microenvironment Impaired cytotoxicity of NK cells is caused by ammonia that decreases perforin levels Ammonia causes NK cell dysfunction