Fecal, oral, and skin biomes of isolated Amerindians show higher human bacterial diversity including antibiotic resistance genes.

Antibiotic-resistant infections annually claim hundreds of thousands of lives worldwide. This problem is exacerbated by exchange of resistance genes between pathogens and benign microbes from diverse habitats. Mapping resistance gene dissemination between humans and their environment is a public health priority. Here we characterized the bacterial community structure and resistance exchange networks of hundreds of interconnected human faecal and environmental samples from two low-income Latin American communities. We found that resistomes across habitats are generally structured by bacterial phylogeny along ecological gradients, but identified key resistance genes that cross habitat boundaries and determined their association with mobile genetic elements. We also assessed the effectiveness of widely used excreta management strategies in reducing faecal bacteria and resistance genes in these settings representative of low- and middle-income countries. Our results lay the foundation for quantitative risk assessment and surveillance of resistance gene dissemination across interconnected habitats in settings representing over two-thirds of the world’s population. An analysis of bacterial community structure and antibiotic resistance gene content of interconnected human faecal and environmental samples from two low-income communities in Latin America was carried out using a combination of functional metagenomics, 16S sequencing and shotgun sequencing; resistomes across habitats are generally structured along ecological gradients, but key resistance genes can cross these boundaries, and the authors assessed the usefulness of excreta management protocols in the prevention of resistance gene dissemination. Mapping the distribution and dissemination of antibiotic resistance genes is a public health priority. Gautam Dantas and colleagues have characterized the bacterial community structure and resistance gene exchange networks from two low-income Latin American communities — a rural village of subsistence farmers 35 km south of San Salvador, El Salvador and a shanty town in the desert hills about 15 km southwest of Lima, Peru. Using functional genomics and whole-metagenome sequencing of hundreds of interconnected human faecal and environmental samples, the authors find that resistomes across habitats are generally structured by bacterial phylogeny along ecological gradients, but that key resistance genes can cross these boundaries. They also assess the usefulness of excreta management protocols in the prevention of resistance gene dissemination. Collectively, this work lays the foundation for quantitative risk assessment and surveillance of antibiotic resistance gene transmission across diverse environments.

Abstract The mechanistic basis for the metastasis of Ewing sarcomas remains poorly understood, as these tumors harbor few mutations beyond the chromosomal translocation that initiates the disease. Instead, the epigenome of Ewing sarcoma (EWS) cells reflects the regulatory state of genes associated with the DNA binding activity of the fusion oncoproteins EWSR1::FLI1 or EWSR1::ERG. In this study, we examined the EWSR1::FLI1/ERG’s repression of transcription factor genes, concentrating on those that exhibit a broader range of expression in tumors than in EWS cell lines. Focusing on one of these target genes, ETS1 , we detected EWSR1::FLI1 binding and an H3K27me3 repressive mark at this locus. Depletion of EWSR1::FLI1 results in ETS1’s binding of promoter regions, substantially altering the transcriptome of EWS cells, including the upregulation of the gene encoding TENSIN3 (TNS3), a focal adhesion protein. EWS cell lines expressing ETS1 (CRISPRa) exhibited increased TNS3 expression and enhanced movement compared to control cells. The cytoskeleton of control cells and ETS1-activated EWS cell lines also differed. Specifically, control cells exhibited a distributed vinculin signal and a network-like organization of F-actin. In contrast, ETS1-activated EWS cells showed an accumulation of vinculin and F-actin towards the plasma membrane. Interestingly, the phenotype of ETS1-activated EWS cell lines depleted of TNS3 resembled the phenotype of the control cells. Critically, these findings have clinical relevance as TNS3 expression in EWS tumors positively correlates with that of ETS1 . Significance ETS1’s transcriptional regulation of the gene encoding the focal adhesion protein TENSIN3 in Ewing sarcoma cells promotes cell movement, a critical step in the evolution of metastasis. Graphical abstract

Abstract Intron retention (IR) is a form of alternative splicing in which an intron that should be spliced out from a precursor transcript, is retained in the mature RNA after the splicing is completed. Although there is emerging evidence of widespread IR in protein-coding genes and long noncoding RNAs (lncRNAs), the underlying molecular mechanisms remain largely unclear. Here, we report the discovery of novel transcripts from the p53-induced lncRNA PURPL, in which intron 2 is retained. To determine the molecular mechanism(s) of IR in PURPL, we conducted a CRISPR-based screen in 3 different cell lines. For this purpose, we utilized a genome-wide guide RNA library expressing a reporter minigene containing the sequence of PURPL intron 2 and its flanking exons. Considering the Percent Intron Retention as readout, we unexpectedly identified proteins of the basal splicing machinery as potential promoting factors of PURPL IR, including the U2-Auxiliary Factor 2 (U2AF2) splicing factor which was one of the top hits of the screen. We next analyzed ENCODE eCLIP-seq datasets to identify RNA binding proteins that could regulate intron 2 and decided to focus on U2AF2 which showed the highest number of binding sites and strongest eCLIP signals within PURPL intron 2 sequence. We validated the effect of U2AF2 by knocking it down, confirming that U2AF2 is a positive regulator of PURPL intron 2 retention as opposed to its canonical function. We also identified the RNA Binding Protein SON as a splicing regulator that acts as an antagonist of U2AF2 in regulating PURPL intron 2 retention. To determine the global impact of U2AF2 knockdown, we performed Iso-Seq and RNA-seq upon U2AF2 depletion. We found that although U2AF2 predominantly acts to promote the splicing of introns in most cellular transcripts, it promotes intron retention in a subset of transcripts. One of these targets is MALAT1, a lncRNA known to play role in splicing by interacting with splicing factors in nuclear speckles. Interestingly, U2AF2 depletion results in MALAT1 exclusion from nuclear speckles. We are currently in the process of characterizing the effect of U2AF2 in the function of the two lncRNAs. These data provide mechanistic insights on PURPL and MALAT1 splicing and function and reveal a previously unrecognized non-canonical function of U2AF2 in promoting intron retention. Citation Format: Ioannis Grammatikakis, Amit Behera, Corrine Corrina R Hartford, Erica C Pehrsson, XiaoLing Li, Yongmei Zhao, Biraj Shrethsa, Tayvia Brownmiller, Natasha J Caplen, Kannanganattu V Prasanth, Thomas Gonatopoulos-Pournatzis, Ashish Lal. Molecular mechanisms of intron retention in Long Non-Coding RNAs [abstract]. In: Proceedings of the AACR Special Conference in Cancer Research: RNAs as Drivers, Targets, and Therapeutics in Cancer; 2024 Nov 14-17; Bellevue, Washington. Philadelphia (PA): AACR; Mol Cancer Ther 2024;23(11_Suppl):Abstract nr A013.

Abstract The RNA binding protein HNRNPH1 is a critical regulator of alternative splicing (AS). We have previously demonstrated that HNRNPH1 mediates an exon exclusion event required for the expression of the mRNA encoding the fusion oncoprotein expressed in a subset (∼37%) of Ewing sarcomas. Furthermore, studies by others have shown that HNRNPH1 regulates a mutually exclusive exon (MXE) AS event (exon-18a versus exon-18b) that defines the expression of TCF3 transcript variants, which, when dysregulated, promotes tumorigenesis in Burkitt’s lymphoma. In this study, we have interrogated the transcriptome-wide effects of depleting HNRNPH1 by RNAi to further explore its regulation of transcripts expressed by cancer-associated genes. We performed whole transcriptome RNA sequencing (RNAseq; short-read, Illumina; long-read, PacBio IsoSeq) of two cell lines (HEK-293T and HT-1080) post 48-hour transfection with a control siRNA (siNeg) or an siRNA targeting HNRNPH1 (siHNRNPH1). We then assembled a workflow to quantify changes in individual AS events (percent-spliced-in, ΔPSI=±0.1) using rMATS and MAJIQ, and differential transcript expression (DTE) using RSEM (pValue≤0.05) and EBSeq (FDR≤0.05). RNAseq analyses were validated using PCR assays. The rMATS analysis revealed skipped exons (SE) as the most frequent event effected in HEK-293T and HT-1080 cells following HNRNPH1 silencing, with 1069 SE or MXE events from 607 genes common to both. Gene annotation (Metascape) of these 607 genes identified 49 as cancer-associated. Consistent with previous studies, we detected a significant change in the TCF3-exon-18a/18b MXE event using rMATS (decreased PSI for 18a) and MAJIQ (negative ΔPSI for 18a and positive ΔPSI for 18b) following HNRNPH1 silencing in both cell lines. Furthermore, DTE revealed a corresponding decrease in 18a-containing TCF3-transcripts and an increase in 18b-containing TCF3-transcripts, validating our analytical pipeline. Next, we extended our analysis to uncharacterized HNRNPH1-regulated AS events, beginning with examination of transcripts encoding the mitotic kinase AURKA. Previous studies have shown that AS of AURKA transcripts localizes to the untranslated regions (UTRs), particularly the 5’UTR. However, regulators of these AS events are unknown, and it is unclear how these UTR variants affect AURKA protein expression. Long-read RNAseq of AURKA mRNAs from both cell lines revealed extensive 5’UTR AS, and the rMATS and MAJIQ analyses showed decreased PSI and negative ΔPSI for a specific 5’UTR-exon following HNRNPH1 silencing. DTE revealed corresponding decreases in abundance of AURKA transcripts containing this exon (AURKA-203, -205, -209, and -213) upon HNRNPH1 depletion, which we confirmed with variant-specific RT-PCR. Furthermore, immunoblot analysis showed a decrease in AURKA protein expression following the silencing of HNRNPH1. Our assessment of AURKA AS suggests HNRNPH1 mediates the inclusion of a specific AURKA-5’UTR-exon, providing evidence for a previously uncharacterized post-transcriptional regulatory mechanism of AURKA expression. Citation Format: Tayvia Brownmiller, Patricio Pichling, Tamara L Jones, Ioannis Grammatikakis, Soumya Sundara Rajan, Erica C Pehrsson. HNRNPH1 regulates the alternative splicing of transcripts expressed by cancer-associated genes [abstract]. In: Proceedings of the AACR Special Conference in Cancer Research: RNAs as Drivers, Targets, and Therapeutics in Cancer; 2024 Nov 14-17; Bellevue, Washington. Philadelphia (PA): AACR; Mol Cancer Ther 2024;23(11_Suppl):Abstract nr A001.

Abstract Epigenetic alterations are widespread in cancer and can complement genetic alterations to influence cancer progression and treatment. To better understand the potential contribution of DNA methylation alterations to tumor phenotype in non-small cell lung cancer (NSCLC) in both smoker and never-smoker patients, we performed a comprehensive, genome-wide profiling of DNA methylation in 17 primary non-small cell lung cancer and 10 matched normal lung samples using the complementary methylation assays MeDIP-seq and MRE-seq. Compared to patient-matched non-malignant lung tissue, we report recurrent methylation changes of several gene promoters, many previously implicated in cancer, including FAM83A and SEPT9 (hypomethylation), and PCDH7 , NKX2-1 , and SOX17 (hypermethylation). Although smoker and never-smoker patients shared many methylation changes, several were specific and recurrent within a particular smoking status. In particular, never-smokers displayed a greater proportion of hypoDMRs and exhibited a greater number of recurrently hypomethylated promoters, including the promoter of the oncogene ASPSCR1 , and others previously linked to cancer, including TOP2A, DPP9, and USP39 . Methylation changes outside of promoters were also widespread and often recurrent, particularly the loss of methylation over repetitive elements, highly enriched for ERV1 subfamilies. Recurrent hypoDMRs were also enriched for several transcription factor (TF) binding motifs, often for genes involved in signaling and cell proliferation, including 71% encoding a binding site of NKX2-1 , which was found to be significantly upregulated in TCGA LUAD samples. Furthermore, the overwhelming majority of DMRs identified in this study were found to reside in an active chromatin state in at least one tissue profiled using the Roadmap Epigenome data, suggesting that methylation changes may contribute to altered regulatory programs through the adaptation of cell type-specific expression programs.