Activation of client proteins by the Hsp90 molecular chaperone is dependent on binding and hydrolysis of ATP, which drives a molecular clamp via transient dimerization of the N-terminal domains. The crystal structure of the middle segment of yeast Hsp90 reveals considerable evolutionary divergence from the equivalent regions of other GHKL protein family members such as MutL and GyrB, including an additional domain of new fold. Using the known structure of the N-terminal nucleotide binding domain, a model for the Hsp90 dimer has been constructed. From this structure, residues implicated in the ATPase-coupled conformational cycle and in interactions with client proteins and the activating cochaperone Aha1 have been identified, and their roles functionally characterized in vitro and in vivo. Activation of client proteins by the Hsp90 molecular chaperone is dependent on binding and hydrolysis of ATP, which drives a molecular clamp via transient dimerization of the N-terminal domains. The crystal structure of the middle segment of yeast Hsp90 reveals considerable evolutionary divergence from the equivalent regions of other GHKL protein family members such as MutL and GyrB, including an additional domain of new fold. Using the known structure of the N-terminal nucleotide binding domain, a model for the Hsp90 dimer has been constructed. From this structure, residues implicated in the ATPase-coupled conformational cycle and in interactions with client proteins and the activating cochaperone Aha1 have been identified, and their roles functionally characterized in vitro and in vivo.

Sister chromatid cohesion is mediated by entrapment of sister DNAs by a tripartite ring composed of cohesin's Smc1, Smc3, and α-kleisin subunits. Cohesion requires acetylation of Smc3 by Eco1, whose role is to counteract an inhibitory (antiestablishment) activity associated with cohesin's Wapl subunit. We show that mutations abrogating antiestablishment activity also reduce turnover of cohesin on pericentric chromatin. Our results reveal a "releasing" activity inherent to cohesin complexes transiently associated with Wapl that catalyzes their dissociation from chromosomes. Fusion of Smc3's nucleotide binding domain to α-kleisin's N-terminal domain also reduces cohesin turnover within pericentric chromatin and permits establishment of Wapl-resistant cohesion in the absence of Eco1. We suggest that releasing activity opens the Smc3/α-kleisin interface, creating a DNA exit gate distinct from its proposed entry gate at the Smc1/3 interface. According to this notion, the function of Smc3 acetylation is to block its dissociation from α-kleisin. The functional implications of regulated ring opening are discussed.

Summary In addition to sharing with condensin an ability to organize DNA into chromatids, cohesin regulates enhancer-promoter interactions and confers sister chromatid cohesion. Association with chromosomes is regulated by hook-shaped HEAT repeat proteins that Associate With its Kleisin (Scc1) subunit (HAWKs), namely Scc3, Pds5, and Scc2. Unlike Pds5, Scc2 is not a stable cohesin constituent but, as shown here, transiently displaces Pds5 during loading. Scc1 mutations that compromise its interaction with Scc2 adversely affect cohesin’s ATPase activity, loading, and translocation while Scc2 mutations that alter how the ATPase responds to DNA abolish loading despite cohesin’s initial association with loading sites. Lastly, Scc2 mutations that permit loading in the absence of Scc4 increase Scc2’s association with chromosomal cohesin and reduce that of Pds5. We suggest that cohesin switches between two states, one with Pds5 bound to Scc1 that is not able to hydrolyse ATP efficiently but is capable of release from chromosomes and another in which Scc2, transiently replacing Pds5, stimulates the ATP hydrolysis necessary for loading and translocation away from loading sites.

Abstract Introduction/Background Dupilumab is a human monoclonal antibody of the IgG4 subclass and binds to the IL-4R alpha subunit, causing downstream inhibition of IL-4 and IL-13 signaling and thus downregulating the T-helper-2 (Th2) cytokine response.1,2,3 Approved by the Food and Drug Administration in 2017, dupilumab is FDA-approved to treat atopic dermatitis (moderate-to-severe), asthma (moderate-to-severe), chronic rhinosinusitis with nasal polyposis, and eosinophilic ­esophagitis. Vitiligo is a common autoimmune depigmenting skin disorder that is prevalent in 1.38% of US adults, and 2.16% in adolescents in the US, with a range of 0.4-2% in most populations.4,5,6 It occurs when the immune system of the body attacks melanocytes, skin cells, that produce melanin, and has been linked to the Koebner phenomenon which occurs when trauma induces lesions, with events including scratching as would be noted in AD.7 AD has also been linked to Vitiligo, especially in children under the age of 12 years.8,9,10 There are many available therapies for vitiligo, topical, systemic, phototherapy, and surgical types being most commonly used.11,12,13 Objectives To address specific features of AA/ Vitiligo/ AD overlap that would support benefit of dupilumab prescribing. Methods An IRB-exempt review was conducted of patient charts for individuals who received dupilumab who had alopecia areata or vitiligo associated with AD. Results Six patients with AD and alopecia universalis (AU), and one patient with AD, vitiligo, and alopecia areata (AA) were identified for review. The patients treated for AU included a 5 year-old Asian female, a 12 year-old white female, a 14 year-old African American male, A 15 year-old Hispanic female, a 26 year-old African American female, and a 78 year-old Hispanic female. The five year-old regrew hair for 4 months but had rapid loss when forced to discontinue due to insurance reasons. The 12 year-old female who had AU for 8 years and had no regrowth. The 15 year-old, 26 year-old, and 78 year-old had rapid regrowth of hair in addition to AD improvement, however, the 15 year-old required addition of an oral JAK inhibitor to retain hair growth. The vitiligo/AA patient is a 61 year-old female patient who had 50% BSA confetti lesion vitiligo affecting the chest, back, abdomen, arms, and legs. She had rapid disease stabilization (2 months) and at 1 year had 90% facial and 70% extremity repigmentation with dupilumab and topical 1.5% ruxolitinib. The same patient had 40% scalp hair loss which fully resolved upon repigmentation of the scalp. Response was noted rapidly but plateaued at 12 months. Conclusions The overlap of AD with AA and Vitiligo points to a shared pathogenesis of the conditions. One of the likely reasons for this is the Koebner phenomenon, which has been poorly characterized. We hypothesize that the Koebner phenomenon is triggered through an IL-4/ IL-13 mechanism, i.e. for specific individuals IL-4 and IL-13 hyper-reactivity can be a Koebner-based trigger. Additionally, AA overlaps with AD is poorly characterized. However, the linkage has been recognized in recent AAD guidelines addressing AD comorbidities.14 We hypothesize that IL-4/ IL-13 hyper-reactivity in the skin can act similarly in AU. There is in AA an overlap of TH1-CXCL9/10 expression and interferon gamma overexpression in addition to TH2- including IL-13 overexpression.15 Therefore, the blockade of IL-4/ IL-13 may be effective through multiple mechanisms of activity. There is already notable Phase 2a data supporting dupilumab usage in AA.16 Our experience demonstrates sustained hair growth in half of patients treated. AA/ Vitiligo overlap appears to respond well to dupilumab. This is supported by a recent case report demonstrating benefit of dupilumab in programmed cell death inhibitor-1 induced vitiligo with associated refractory pruritus.17 Liu et al have observed in vitro that rising IL-4 levels were linked to increased vitiligo risk.18 On the other hand, some reports of vitiligo after initiating dupilumab therapy do exist, with some new-onset and worsening described. These cases are limited but bear consideration. In our patient, disease stabilization was noted in a generalized confetti-vitiligo patient, but a topical JAK inhibitor was used adjunctively.19,20,21,22,23 Given the need for long-term maintenance, the safety of dupilumab is an attractive feature. Therefore, further exploration of dupilumab therapy for vitiligo/AA/AD, vitiligo/AD/Koebner+, and AU/ AD is needed. This is particularly important to address in patients under the age of 12 years who currently have no approved systemic medications for vitiligo and AU.24 When AU, vitiligo, and combinations of the two are comorbid with AD, there is an expectation of circulating IL-4/13 elevations and localized IL-4/13 elevation that support a potential role for dupilumab therapy in these conditions. Given that AD is associated with vitiligo of childhood, and severe alopecia areata is linked to AD, systemic therapy would be necessary in these individuals.

Abstract The ring-shaped cohesin complex is the key player in sister chromatid cohesion, DNA repair, and gene transcription. The loading of cohesin to chromosomes requires the loader Scc2 and is regulated by ATP. This process is also hindered by Smc3 acetylation. However, the molecular mechanism underlying this inhibition remains mysterious. Here we identify a novel configuration of Scc2 with pre-engaged cohesin and reveal dynamic conformations of the cohesin/Scc2 complex in the loading reaction. We demonstrate that Smc3 acetylation blocks the association of Scc2 with pre-engaged cohesin by impairing the interaction of Scc2 with Smc3’s head. Lastly, we show that ATP binding induces the cohesin/Scc2 complex to clamp DNA by promoting the interaction between Scc2 and Smc3 coiled coil. Our results illuminate a dynamic reconfiguration of the cohesin/Scc2 complex during loading and indicate how Smc3 acetylation and ATP regulate this process.

Abstract Drug-induced gene expression profiles can identify potential mechanisms of toxicity. We focused on obtaining signatures for cardiotoxicity of FDA-approved tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Using bulk transcriptomics profiles, we applied singular value decomposition to identify drug-selective patterns in cell lines obtained from multiple healthy human subjects. Cellular pathways affected by highly cardiotoxic TKIs include energy metabolism, contractile, and extracellular matrix dynamics. Projecting these pathways to single cell expression profiles indicates that TKI responses can be evoked in both cardiomyocytes and fibroblasts. Whole genome sequences of the cell lines, using outlier responses enabled us to correctly reidentify a genomic variant associated with anthracycline cardiotoxicity and predict genomic variants potentially associated with TKI cardiotoxicity. We conclude that mRNA expression profiles when integrated with publicly available genomic, pathway, and single cell transcriptomic datasets, provide multiscale predictive understanding of cardiotoxicity for drug development and patient stratification. One sentence summary Genes, pathways, and cell types of the human heart associated with antineoplastic drug cardiotoxicity.

As predicted by the notion that sister chromatid cohesion is mediated by entrapment of sister DNAs inside cohesin rings, there is a perfect correlation between co-entrapment of circular minichromosomes and sister chromatid cohesion in a large variety of mutants. In most cells where cohesin loads onto chromosomes but fails to form cohesion, loading is accompanied by entrapment of individual DNAs. However, cohesin with a hinge domain whose positively charged lumen has been neutralized not only loads onto and translocates along chromatin but also organizes it into chromatid-like threads, despite largely failing to entrap DNAs inside its ring. Thus, cohesin engages chromatin in a non-topological as well as a topological manner. Our finding that hinge mutations, but not fusions between Smc and kleisin subunits, abolish entrapment suggests that DNAs may enter cohesin rings through hinge opening. Lastly, mutation of three highly conserved lysine residues inside the Smc1 moiety of Smc1/3 hinges abolishes all loading without affecting cohesin's initial recruitment to CEN loading sites or its ability to hydrolyze ATP. We suggest that loading and translocation are mediated by conformational changes in cohesin's hinge driven by cycles of ATP hydrolysis.

Cardiotoxicity (CT) involving diminished cardiac contractility and heart failure is a major adverse event associated with otherwise efficacious protein kinase inhibitors (KIs). Here, we sought to develop clinically-weighted transcriptomic signatures to predict risk of CT and to better understand the biological processes associated with CT risk. We obtained transcriptome-wide response profiles in four human primary cardiomyocyte cell lines that were treated with 22 different KIs using mRNA sequencing with 3' digital gene expression. The FDA Adverse Event Reporting System was used to derive relative risk scores for four types of CT for different KIs. We used elastic net regression to associate these transcriptomic profiles with KI-associated risk scores for CT subtypes to obtain clinically-weighted transcriptomic signatures, which showed good predictive properties (cross-validation R2 >0.87). Our clinically-weighted transcriptomic signatures for KI-associated CT may be of relevance in early drug development for the prediction of KI-associated CT.

Western blotting is often considered a semi-quantitative or even qualitative assay for assessing changes in protein or protein post-translational modification levels. Fluorescence-based measurement enables acquisition of quantitative data in principal, but requires determining the linear range of detection for each antibody, a labor-intensive task. Here, we describe the use of a high-throughput western blotting technique called microwestern array to more rapidly evaluate suitable conditions for quantitative western blotting with particular antibodies. We can evaluate up to 192 antibody/dilution/replicate combinations on a single standard size gel with a seven-point, two-fold lysate dilution series (~100-fold range). Pilot experiments demonstrate a surprisingly high proportion of investigated antibodies (17/22) are suitable for quantitative use, and that lack of validity might often be a consequence of lysate composition rather than antibody quality. Linear range for all validated antibodies is at least 8-fold, and in some cases nearly two orders of magnitude. That range could be greater as the presented tests did not find a limit for many antibodies. We find that phospho-specific and total antibodies do not have discernable trend differences in linear range or limit of detection, but total antibodies generally required higher working concentrations, suggesting phospho-specific antibodies may be generally higher affinity. Importantly, we demonstrate that results from microwestern analyses scale to normal 'macro' western for a subset of antibodies. These data indicate that with initial validation, many antibodies can be readily used quantitatively in a reproducible manner. Antibody validation data and standard operating procedures are available online (www.birtwistlelab.com/protocols and www.dtoxs.org).

Abstract PPMV-1, an antigenic variant of APMV-1, associated with specific pigeon host species. However, its evolutionary strategy and underlying drivers of host specificity remain unknown. In this study, we collect the outbreak data on a global scale to investigate its evolutionary dynamics, and provide an evidence-supported analysis the host shift of PPMV-1 from chickens to pigeons, and this shift is driven by the P protein. Our data indicated that the viruses in the United States and China have undergone convergent evolution. We find that three mutations of P protein, especially R163G, can significantly affect the adaptation of APMV-1 in pigeons. Mechanistically, sensor LSm14A inhibits the replication APMV-1 in DF-1 cells, and R163G substitutionon P protein increase LSm14A degradation. We propose the host shift drive the evolution of PPMV-1 and the underlying mechanism, offering new insights into the adaptive evolutionary process of the virus.