Schizophrenia is a common disease with a complex aetiology, probably involving multiple and heterogeneous genetic factors. Here, by analysing the exome sequences of 2,536 schizophrenia cases and 2,543 controls, we demonstrate a polygenic burden primarily arising from rare (less than 1 in 10,000), disruptive mutations distributed across many genes. Particularly enriched gene sets include the voltage-gated calcium ion channel and the signalling complex formed by the activity-regulated cytoskeleton-associated scaffold protein (ARC) of the postsynaptic density, sets previously implicated by genome-wide association and copy-number variation studies. Similar to reports in autism, targets of the fragile X mental retardation protein (FMRP, product of FMR1) are enriched for case mutations. No individual gene-based test achieves significance after correction for multiple testing and we do not detect any alleles of moderately low frequency (approximately 0.5 to 1 per cent) and moderately large effect. Taken together, these data suggest that population-based exome sequencing can discover risk alleles and complements established gene-mapping paradigms in neuropsychiatric disease. Exome sequence analysis of more than 5,000 schizophrenia cases and controls identifies a polygenic burden primarily arising from rare, disruptive mutations distributed across many genes, among which are those encoding voltage-gated calcium ion channels and the signalling complex formed by the ARC protein of the postsynaptic density; as in autism, mutations were also found in homologues of known targets of the fragile X mental retardation protein. Two major sequencing studies of the exome — the protein-coding portion of the genome — in schizophrenia sufferers and their relatives are published in this issue of Nature. Together they provide strong pointers to specific pathogenic mechanisms that disrupt the glutamatergic synapses in schizophrenia. In particular, mutations that influence the action of the scaffold protein ARC (activity-regulated cytoskeleton-associated protein) are prominently involved, as are mutations in targets of the fragile X mental retardation protein (FMRP). Defects in FMRP have previously been shown to be associated with autism spectrum disorders.

A small number of rare, recurrent genomic copy number variants (CNVs) are known to substantially increase susceptibility to schizophrenia. As a consequence of the low fecundity in people with schizophrenia and other neurodevelopmental phenotypes to which these CNVs contribute, CNVs with large effects on risk are likely to be rapidly removed from the population by natural selection. Accordingly, such CNVs must frequently occur as recurrent de novo mutations. In a sample of 662 schizophrenia proband-parent trios, we found that rare de novo CNV mutations were significantly more frequent in cases (5.1% all cases, 5.5% family history negative) compared with 2.2% among 2623 controls, confirming the involvement of de novo CNVs in the pathogenesis of schizophrenia. Eight de novo CNVs occurred at four known schizophrenia loci (3q29, 15q11.2, 15q13.3 and 16p11.2). De novo CNVs of known pathogenic significance in other genomic disorders were also observed, including deletion at the TAR (thrombocytopenia absent radius) region on 1q21.1 and duplication at the WBS (Williams-Beuren syndrome) region at 7q11.23. Multiple de novos spanned genes encoding members of the DLG (discs large) family of membrane-associated guanylate kinases (MAGUKs) that are components of the postsynaptic density (PSD). Two de novos also affected EHMT1, a histone methyl transferase known to directly regulate DLG family members. Using a systems biology approach and merging novel CNV and proteomics data sets, systematic analysis of synaptic protein complexes showed that, compared with control CNVs, case de novos were significantly enriched for the PSD proteome (P=1.72 × 10⁻⁶. This was largely explained by enrichment for members of the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) (P=4.24 × 10⁻⁶) and neuronal activity-regulated cytoskeleton-associated protein (ARC) (P=3.78 × 10⁻⁸) postsynaptic signalling complexes. In an analysis of 18 492 subjects (7907 cases and 10 585 controls), case CNVs were enriched for members of the NMDAR complex (P=0.0015) but not ARC (P=0.14). Our data indicate that defects in NMDAR postsynaptic signalling and, possibly, ARC complexes, which are known to be important in synaptic plasticity and cognition, play a significant role in the pathogenesis of schizophrenia.

Article19 May 2009Open Access Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins Esperanza Fernández Esperanza Fernández Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Mark O Collins Mark O Collins Proteomic Mass Spectrometry, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Rachel T Uren Rachel T Uren Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Maksym V Kopanitsa Maksym V Kopanitsa Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Noboru H Komiyama Noboru H Komiyama Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Mike D R Croning Mike D R Croning Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Lysimachos Zografos Lysimachos Zografos School of Informatics, Edinburgh University, Edinburgh, UK Search for more papers by this author J Douglas Armstrong J Douglas Armstrong School of Informatics, Edinburgh University, Edinburgh, UK Search for more papers by this author Jyoti S Choudhary Jyoti S Choudhary Proteomic Mass Spectrometry, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Seth G N Grant Corresponding Author Seth G N Grant Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Esperanza Fernández Esperanza Fernández Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Mark O Collins Mark O Collins Proteomic Mass Spectrometry, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Rachel T Uren Rachel T Uren Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Maksym V Kopanitsa Maksym V Kopanitsa Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Noboru H Komiyama Noboru H Komiyama Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Mike D R Croning Mike D R Croning Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Lysimachos Zografos Lysimachos Zografos School of Informatics, Edinburgh University, Edinburgh, UK Search for more papers by this author J Douglas Armstrong J Douglas Armstrong School of Informatics, Edinburgh University, Edinburgh, UK Search for more papers by this author Jyoti S Choudhary Jyoti S Choudhary Proteomic Mass Spectrometry, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Seth G N Grant Corresponding Author Seth G N Grant Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK Search for more papers by this author Author Information Esperanza Fernández1, Mark O Collins2, Rachel T Uren1, Maksym V Kopanitsa1, Noboru H Komiyama1, Mike D R Croning1, Lysimachos Zografos3, J Douglas Armstrong3, Jyoti S Choudhary2 and Seth G N Grant 1 1Genes to Cognition Programme, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK 2Proteomic Mass Spectrometry, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK 3School of Informatics, Edinburgh University, Edinburgh, UK *Corresponding author. Genes to Cognition Programme, Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire CB10 1SA, UK. Tel.: +44 0 1223 494 908; Fax: +44 0 1223 494 919; Molecular Systems Biology (2009)5:269https://doi.org/10.1038/msb.2009.27 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions Figures & Info The molecular complexity of mammalian proteomes demands new methods for mapping the organization of multiprotein complexes. Here, we combine mouse genetics and proteomics to characterize synapse protein complexes and interaction networks. New tandem affinity purification (TAP) tags were fused to the carboxyl terminus of PSD-95 using gene targeting in mice. Homozygous mice showed no detectable abnormalities in PSD-95 expression, subcellular localization or synaptic electrophysiological function. Analysis of multiprotein complexes purified under native conditions by mass spectrometry defined known and new interactors: 118 proteins comprising crucial functional components of synapses, including glutamate receptors, K+ channels, scaffolding and signaling proteins, were recovered. Network clustering of protein interactions generated five connected clusters, with two clusters containing all the major ionotropic glutamate receptors and one cluster with voltage-dependent K+ channels. Annotation of clusters with human disease associations revealed that multiple disorders map to the network, with a significant correlation of schizophrenia within the glutamate receptor clusters. This targeted TAP tagging strategy is generally applicable to mammalian proteomics and systems biology approaches to disease. Synopsis Systems biology has the potential to explain physiological processes as emergent properties of sets of genes and proteins. Beyond simple cellular systems, the challenge of delivering systems biology into the intact and freely behaving animal will require new methods. Currently, the most widely used approach is immunoprecipitation of the target protein and its associate binding proteins. This method suffers from the drawbacks of single step purification strategies that include a high level of non-specific background proteins amongst other limitations. To overcome these limitations we demonstrate that the tandem affinity purification (TAP) technology originally developed in yeast (Rigaut et al, 1999), when combined with gene targeting, can be used to efficiently isolate highly specific complexes from mouse. The ‘targeted TAP tagging’ strategy combines the two major advantages of each system. The first advantage is that the insertion of two tags into the protein of interest allows two consecutive purification steps that facilitate the recovery of protein complexes with high confidence and decreases the recovery of non-specific proteins or weak interactors. The second advantage, conferred by targeting the endogenous gene, is that the tagged protein is expressed under its natural regulatory mechanisms. We have designed an endogenous TAP targeting strategy to isolate complexes from mouse brain excitatory synapses. The brain is the most complex organ from a cellular and molecular perspective and thus an ideal model to explore the TAP method. Post Synaptic Density 95 (PSD-95/Dlg4) is an adaptor protein comprised of PDZ, SH3 and GK domains and is expressed in the postsynaptic terminal of excitatory synapses where it organizes signaling from neurotransmitter receptors to downstream pathways (Kornau et al, 1995; Hunt et al, 1996; Tu et al, 1999; Husi et al, 2000; Nehring et al, 2000; Dosemeci et al, 2007; Carlisle et al, 2008). Mice carrying a knockout mutation in PSD-95 show it is essential for synaptic plasticity and a range of important behaviours (Migaud et al, 1998; El-Husseini et al, 2000; Beique et al, 2006). Here, a new TAP tag was fused to the carboxyl terminus of PSD-95 using gene targeting in mice. Homozygous mice showed no detectable abnormalities in PSD-95 expression, subcellular localization or synaptic electrophysiological function (Figure 2). As a result of four independent tandem purifications and mass spectrometry analysis, we were able to define PSD-95 core complexes with high sensitivity and reproducibility. The four purifications show an average of 125±19 proteins, having 118 proteins (94%) common in at least three of four replicates. This reproducibility rate is among the highest rate reported for systematic protein complex isolation. To further validate this interaction data we compared it to information from public datasets. Of the 118 proteins, 22% were proteins that directly bind PSD-95 and 18% were proteins not previously found in other PSD-95 analysis. All together, these data show robust reproducibility and sensitivity of this method for purifying synaptic complexes. These PSD-95 core complexes comprise key functional components of synapses including the glutamate neurotransmitter receptors, K+ channels, scaffolding and signaling proteins. These complexes contain ionotropic glutamate receptors of the NMDA, AMPA and kainate subtypes as well as major K+ channels that together are the major postsynaptic constituents responsible for synaptic transmission and shaping the postsynaptic electrophysiological response to presynaptic input (Watanabe et al, 2002; Chen et al, 2006; Kim et al, 2007). We believe that this is the first method that has allowed the robust copurification of these proteins. To explore functional organization using network models, we manually curated interactions (Pocklington et al, 2006) and the UniHi database (http://www.mdc-berlin.de/unihi) to identify 119 interactions between 50 proteins (excluding self-interactions) of the PSD-95 core complexes. Network clustering of the interacting proteins showed 40 out of the 50 proteins formed a large connected component (major connected component, MCC) and a modular structure that was segregated into 5 clusters referred to as cluster a (Cla) to cluster e (Cle) (Figure 5A). In addition to the 5 MCC clusters, 2 further disconnected clusters (‘Clf’ and ‘Clg’) were found. Of great interest is the location and proximity of the receptors and channels responsible for the postsynaptic depolarization and subsequent action potential generation. All NMDA, AMPA and kainate glutamate receptors were restricted to Cla and Clb and the voltage-dependent K+ channels were found in Cla and Clc (entirely comprised of K+ channels). It therefore appears that Cla, Clb and Clc are enriched with membrane proteins responsible for electrical properties of the postsynaptic terminal. The central role of PSD-95 was supported by calculation of the shortest path from each protein to every other protein and PSD-95 showed the lowest. Annotation of clusters with human disease associations revealed that multiple disorders map onto the network with a highly significant correlation of schizophrenia within the glutamate receptor clusters (P<10−6). 20 genes involved in schizophrenia were significantly associated with the clusters Cla and Clb that contains all the glutamate receptors and MAGUK/Dlg proteins (Figure 5B). Mapping the primary interactors of these schizophrenia proteins recruited many other proteins found in the other modules of the network. This suggests that the overall network and its different modules are a substrate for schizophrenia, and not simply the glutamate receptors, as was generally considered in the ‘glutamate hypothesis’ of schizophrenia (Greene, 2001; Coyle, 2006; Lisman et al, 2008). This targeted TAP tagging strategy is generally applicable to mammalian proteomics and systems biology approaches to disease. TAP tagged mice are a valuable resource and useful for a wide range of physiological studies and whole animal studies. Introduction Synapses are fundamental structural and functional units of the nervous system responsible for information processing. Their principal role is the transmission of electrical activity by the release of neurotransmitter from the presynaptic terminal onto postsynaptic receptors and ion channels. Postsynaptic ionotropic receptors initiate the postsynaptic depolarization that elicits action potential generation in the postsynaptic neuron. The second major role is the detection and processing of information contained in the patterns of electrical activity. This is achieved by the coupling of neurotransmitter receptors to second-messenger signaling pathways that modulate downstream effectors, ranging from modulation of ion channels themselves to structural changes and gene expression. In recent years, proteomic studies have revealed that mammalian synapses comprise up to 2000 proteins in the presynaptic and postsynaptic terminals (Husi et al, 2000; Walikonis et al, 2000; Husi and Grant, 2001; Sheng and Kim, 2002; Peng et al, 2004; Takamori et al, 2006; Trinidad et al, 2008). To understand the macromolecular organization of complexes and substructures, isolation of complexes by antibody, peptide and ligand affinity methods was used to recover smaller sets of proteins (Husi et al, 2000; Farr et al, 2004; Collins et al, 2006; Dosemeci et al, 2007; Klemmer et al, 2009; Paulo et al, 2009). These methods generally involve a single purification step, which is limited by the specificity of the affinity reagent and potentially recovers more contaminants than those with multiple steps. Furthermore, these protocols are not generally suitable for recovery of native complexes in solution, which could be used for enzymatic and structural studies. A potential solution to this major problem has been achieved in yeast through genetic modification of the endogenous protein by fusion with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag into the C- or N-terminus of the protein of interest (Rigaut et al, 1999). This tagged protein can be isolated (with its associated proteins) in a tandem procedure, overcoming many of the inherent specificity and sensitivity limitations of traditional fractionation methods, as well as antibody, ligand and peptide affinity purification methods. In mammalian tissues, where developmental and cell-type control of regulation is more complex, the targeting of the TAP tag into the endogenous gene provides advantages over transgenic random integration or cDNA overexpression systems (Knuesel et al, 2003; Bouwmeester et al, 2004; Brajenovic et al, 2004; Drakas et al, 2005; Wang et al, 2005, 2006; Angrand et al, 2006; Burckstummer et al, 2006). For those reasons we chose to explore TAP tagging in mammals using gene targeting in mouse. Our first aim was to test TAP tagging using a gene-targeting approach in mice, with the specific objective of purifying signaling complexes from the synapse. We generated knockin mice in which TAP tags were inserted into the endogenous locus of post synaptic density-95 (PSD-95), which is one of the most abundant scaffold proteins at excitatory brain synapses (Nourry et al, 2003; Peng et al, 2004). PSD-95 is localized to the postsynaptic compartment in which it interacts with neurotransmitter receptors and ion channels to assemble signaling complexes (Kornau et al, 1995; Hunt et al, 1996; Tu et al, 1999; Husi et al, 2000; Nehring et al, 2000; Dosemeci et al, 2007) controlling neuronal plasticity (Migaud et al, 1998; Carlisle et al, 2008; Cuthbert et al, 2007) underlying learning and memory (Migaud et al, 1998), pain (Garry et al, 2003) and drug addiction (Yao et al, 2004). Our second aim was to integrate TAP tag proteomic data with systems biology approaches to analyze the organization and function of complexes. We show the first example of gene-targeted TAP tagging in mice and show that the tagging did not introduce a mutation or alter the expression or localization of the protein. Clear advantages of two-step purification methods over the existing single-step methods were found. Mass spectrometry analysis of four replicates of the purification revealed that PSD-95-associated complexes comprise the principal ionotropic glutamate receptors and K+ channels in addition to important signaling proteins. Text mining and systematic annotation together with clustering of proteins using protein interaction data revealed the network substructure with a core subnetwork involved in schizophrenia. Results A strategy for purification of in vivo multiprotein complexes We used a TAP tag consisting of a poly-histidine affinity tag (HAT) and a triple FLAG tag (Terpe, 2003) in tandem, separated by a unique TEV-protease cleavage site (Figure 1A). This 5-kDa tag is considerably smaller than the tag first applied in yeast (20 kDa) (Rigaut et al, 1999) and exploits the specificity of both FLAG and HAT-tag binding. Targeting the endogenous gene allows a thorough testing of the potential mutant phenotype by breeding to homozygosity and comparing with the existing mutant mice. Figure 1.Generation of Tandem Affinity Purification (TAP)-tagged PSD-95 knockin mice. (A) Domain structure of TAP modified PSD-95. PSD-95 domains, including three PDZ (PSD-95/discs large/zona occludens), a SH3 (Src homology 3), a GK (guanylate kinase) and C-terminal TAP-tag domain. Amino-acid sequence of the TAP tag comprising a histidine affinity tag (HAT)-domain (bold), a TEV site (underlined) and a 3XFLAG domain (bold) separated by a spacer. (B) Scheme of the targeted genomic PSD-95/Dlg4 locus. The Dlg4 allele was targeted with the TAP sequence inserted before the stop codon. Crossing the transgenic Cre-recombinase-expressing mice deleted the neomycin resistance cassette (neo) between loxP sites (bottom). Asterisk: stop codon of the coding sequence; black thick lane: TAP tag sequence; triangle: loxP site. (C) PCR genotyping of TAP-tagged PSD-95 mice, using a common forward primer PSD-95 F5 and two reverse primers PSD-95 R6 and pneoR4, which amplify the wild type (upper band) and targeted allele (lower band), respectively. (D) Immunoblot with PSD-95 antibody for immunoprecipitations. Three different heterozygous mice are shown (PSD-95TAP/+, left panel). PSD-95TAP/+ forebrain was also affinity purified with a FLAG antibody (right panel). (E) PSD-95 protein expression in wt and PSD-95TAP/TAP mouse forebrains. Brain lysates of 5, 10 and 15 μg were loaded and immunoblotted with antibodies against PSD-95 (upper panel) and tubulin (lower panel), which is a loading control. Wt, wild type; PSD-95TAP/TAP, homozygous TAP-tagged PSD-95 mice; c-, PCR water; IgG, mouse total IgG used as a negative control of the immunoprecipitation. Download figure Download PowerPoint Generation of a TAP-tagged PSD-95 knockin mouse line We chose to test TAP tagging in mice, with a focus on PSD-95 as a first model gene for the following reasons: (i) PSD-95 has discrete expression in the postsynaptic compartment of excitatory synapses of the brain, (ii) PSD-95 mutant mice are well characterized and show robust phenotypes in electrophysiological studies of synapses and behavior (Migaud et al, 1998; El-Husseini et al, 2000; Yao et al, 2004; Beique et al, 2006), and (iii) this protein has been extensively studied using methods that identify binary interaction partners (Kim and Sheng, 2004). PSD-95 is a scaffold protein with three PDZ domains, an SH3 and a guanylate kinase domain that mediate protein interactions (Figure 1A). As mouse PSD-95 is known to have multiple isoforms generated by multiple promoters and all forms utilize a common C-terminus (Bence et al, 2005), the TAP tag was inserted into the open reading frame in the 3′-end before the stop codon of exon 19, using Escherichia coli recombineering-based methods (Zhou et al, 2004) (Figure 1B). The final targeting vector, containing a 5′-end homology arm of 6.3 kb and a 3′-end homology arm of 2.9 kb, was transfected into ES cells and integration was detected using standard methods. PCR of neomycin-resistant ES-cell DNA confirmed the expected 3388 bp band in 16 clones (targeting efficiency was 5.6%), and germline transmission of the TAP-tag insertion was established (Figure 1C). This line of mice is referred to herein as PSD-95TAP. Normal expression and synaptic localization of TAP-tagged PSD-95 We first intercrossed PSD-95TAP heterozygous mice (PSD-95TAP/+) and found no distortion of transmission frequency in the offspring of PSD-95TAP/+ intercrosses (data not shown). We next examined protein expression of TAP-tagged PSD-95 to ensure that introduction of the tag into the gene did not affect the expression and localization of the tagged protein. The solubilization conditions used here have been reported as the best conditions to mostly purify N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors and PSD-95 from adult mouse brain (Husi and Grant, 2001). The forebrain tissue was solubilized from heterozygous (PSD-95TAP/+) mice and PSD-95 was immunoprecipitated and immunoblotted using an anti-PSD-95 antibody (Figure 1D). Two bands of similar intensity were observed, where the upper band corresponded to the TAP-tagged PSD-95 (confirmed by immunoprecipitation using anti-FLAG antibody, right panel) and the lower band to the endogenous PSD-95. Comparison of extracts (5, 10, 15 μg) from wild-type (wt) and homozygous (PSD-95TAP/TAP) mice showed similar amounts of PSD-95 on immunoblots compared with an internal control immunoblot using anti-tubulin antibody (Figure 1E). We next carried out immunohistochemistry with an anti-PSD-95 antibody on sagittal brain sections to examine the expression pattern of TAP-tagged PSD-95. As shown in Figure 2A, the expression pattern of PSD-95 in PSD-95TAP/TAP brain was the same as in the brains of wt animals, with the highest expression in the CA1 area, dentate gyrus, cortex, cerebellum and lower expression in striatum and brainstem (Figure 2A). There was no detectable abnormality of brain morphology in the PSD-95TAP/TAP mice. As shown in Figure 2B, the expression of PSD-95 in the hippocampal subfields was unaffected by the genetic manipulation and particularly in the stratum radiatum, where the electrophysiological experiments were carried out (described below), was normal. Figure 2.Analysis of TAP-tagged PSD-95 localization and synaptic plasticity in PSD-95TAP/TAP mice. (A) Immunohistochemical staining of PSD-95 in sagittal brain sections from PSD-95TAP/TAP and wt mice. B, brainstem; C, cortex; CB, cerebellum; H, hippocampus; S, striatum. Scale bar=1 mm. (B) Immunohistochemical staining of PSD-95 in sagittal hippocampus sections from PSD-95TAP/TAP and wt mice showing CA1, CA3 and dentate gyrus (DG). Scale bar=1 mm. (C) Synaptic localization of TAP-tagged PSD-95 in primary hippocampus neurons. DIV14 neurons from wt and PSD-95TAP/TAP mice were stained with PSD-95 and MAP2B antibodies (top panels). Three lower panel show PSD-95 and FLAG antibody staining in a culture from PSD-95TAP/TAP mice (bottom panels). Inset panels show higher magnification of synaptic puncta labeling with each antibody and merged image. Scale bar=10 μm. (D) Long-term potentiation of fEPSPs induced by theta-burst stimulation in CA1 area of hippocampal slices is similar in PSD-95TAP/TAP (13 slices from 4 animals) and wild-type mice (15 slices from 4 animals). Download figure Download PowerPoint To examine the synaptic localization of TAP-tagged PSD-95, we cultured embryonic hippocampal neurons from PSD-95TAP/TAP and wt mice. The specific subcellular localization of PSD-95 to the postsynaptic compartment of synapses (dendritic spines) was monitored using postsynaptic markers for glutamate neurotransmitter receptors (GluR1 or NR1), presynaptic marker (synaptophysin) and dendritic markers (MAP2) (Figure 2B and Supplementary Figure 1). Similar to PSD-95 staining in wt neurons, TAP-tagged PSD-95 was localized to punctate structures along the length of dendrites in PSD-95TAP/TAP neurons (Figure 2C, top panels). FLAG staining also shows the punctate structures in PSD-95TAP/TAP neurons (Figure 2C, bottom panels). Synaptophysin staining shows typical juxtaposition, indicating that TAP-tagged PSD-95 is found at synapses in PSD-95TAP/TAP neurons (Supplementary Figure 1, top panels). Furthermore, the co-localization of GluR1 and NR1 subunits with TAP-tagged PSD-95 (Supplementary Figure 1, middle and bottom panels, respectively) confirms its postsynaptic localization in the excitatory synapses, just as occurs for wt PSD-95. The TAP tag does not affect the synaptic electrophysiology Knockout mutations or overexpression of PSD-95 results in striking changes in synaptic physiology (Migaud et al, 1998; El-Husseini et al, 2000; Beique et al, 2006). In particular, long-term potentiation (LTP) of the excitatory synaptic transmission is greatly enhanced in PSD-95 knockout mice (Migaud et al, 1998; Komiyama et al, 2002; Beique et al, 2006). To determine whether TAP tagging of PSD-95 also altered the synaptic physiology, we studied short- and long-term plasticity in hippocampal slices of PSD-95TAP/TAP mice (Figure 2D). A short episode of theta-burst stimulation was used to induce LTP of field extracellular post-synaptic potentials (fEPSPs) in the CA1 area of the hippocampus. In the period of 60–65 min after theta-burst stimulation, amplitudes of fEPSPs in the test pathway normalized relative to control pathway were not different between PSD95TAP/TAP and wt mice (194±15% versus 176±8%; P=0.295) (Figure 2D). Likewise, paired-pulse facilitation, an established measure of short-term plasticity, was similar in wt and PSD-95TAP/TAP animals (Supplementary Figure 2), whereas it is known that this parameter is significantly enhanced in PSD-95 knockout mice (Migaud et al, 1998; Beique et al, 2006). Therefore, we conclude that the engineering of the TAP tag into PSD-95 using the knockin strategy has not altered the synaptic physiological function of PSD-95. Together, the physiological, biochemical, tissue and subcellular localization studies indicate that the presence of the TAP tag did not significantly alter the expression or function of PSD-95. Optimization of single-step and tandem affinity purification of PSD-95-associated complexes The following four-stage protocol for isolation of PSD-95 complexes was used (Figure 3A). First, TAP-tagged PSD-95 (from homozygous PSD-95TAP/TAP mice) was captured from brain extracts with an anti-FLAG antibody covalently coupled to Dynal beads. Second, the complex was eluted by cleavage with TEV protease completing the single step of purification. In the third stage, the complex was recovered from solution by Ni2+–NTA–agarose column that binds the HAT-tagged PSD-95. The fourth and final stage was the release of the PSD-95 complex from the column using imidazole, completing the tandem purification. Figure 3.Tandem affinity purification of PSD-95 complexes. (A) Overview of the TAP protocol. In the first step, the TAP-tagged PSD-95 was captured by FLAG antibody (1) and eluted by TEV cleavage (2). Cleaved TAP-tagged PSD-95 was then captured with Ni2+–NTA–agarose beads (3) and eluted with 250 mM imidazole (4). (B) TAP-tagged PSD-95 was affinity purified with FLAG antibody from forebrain extracts from PSD-95TAP/TAP (left panel) and wt (right panel) mice, then cleaved using TEV protease (TEV) and monitored using immunoblotting with a PSD-95 antibody. The eluted (El) and column retained PSD-95 (BB) are shown. TEV protease was added to the reaction as indicated (TEV) or to control without TEV (non-TEV). Input, total lysate; El, elution after TEV reaction; BB, beads boiled with Laemmli sample buffer after TEV cleavage. (C) HAT-tagged PSD-95 purification monitored using immunoblotting against PSD-95. Following TEV cleavage the eluate (TEV El) was incubated with Ni2+–NTA–agarose, washed and eluted by imidazole 250 mM and collected in 7 fractions. TEV, TEV elution before the Ni2+ column; SN, supernatant remaining after coupling to the Ni2+ column; 1–7, fractions recovered in the imidazole elution. BB, boiled Ni2+–agarose beads after elution. (D) TAP-tagged PSD-95 complex was affinity purified using FLAG antibody (single step, left gel) and tandem (two step, right panel) from wt and PSD-95TAP/TAP forebrain and resolved by SDS–PAGE stained with colloidal Coomasie stain. The lanes were cut for mass spectrometry analysis and the identified proteins listed in Supplementary Table 1. PSD-95 and the TEV enzyme are indicated in both gels. (E) Schematic representation of the total number (301) of proteins identified in the combined single and tandem purifications. In four independent tandem purifications, a total of 158 proteins were identified and 118 appeared in at least three of four replicates (PSD-95 core complexes). (F) Venn diagram with the number of proteins from either single or tandem purifications showing the common proteins (87) and proteins masked (71) in the single-step purification. Download figure Download PowerPoint We examined the efficiency of the different steps in this protocol by monitoring PSD-95. All the solubilized PSD-95 was captured by FLAG-Dynal beads and >90% was cleaved using TEV protease (Supplementary Figure 3A). In the absence of TEV, there was no spontaneous release of TAP-tagged PSD-95 during incubations (Figure 3B, lane 4, 5 Non-TEV, El lane). TEV incubation released 50–70% of cleaved PSD-95 (Figure 3B, lane 2, El) and 30–50% of cleaved PSD-95 remained on the beads (Figure 3B, lane 3, BB). TEV had efficiently cleaved the retained protein as the size of PSD-95 in the BB lane corresponded to cleaved TAP-tagged PSD-95, and moreover, was not recognized by anti-FLAG antibodies on immunoblotting (Supplementary Figure 3A, comparison of BB lanes). This partial retention of cleaved protein seems to be a protein-specific phenomenon as we have observed this with other proteins studied in a similar manner (data not shown). For other controls, as expected, the FLAG antibody did not precipitate PSD-95 from wt mouse forebrain (Figure 3B, right panel). The recovery of PSD-95 using a Ni2+–NTA–agarose column that binds the HAT-tagged PSD-95 was very efficient (>95%) (Figure 3C, lanes 2 and 3, TEV El, SN). Subsequent elution using imidazole was also highly efficient (>95%) (no detectable retained-PSD-95 in BB lane, Figure 3C). Overall, we estimate that

The CYFIP1/SRA1 gene is located in a chromosomal region linked to various neurological disorders, including intellectual disability, autism, and schizophrenia. CYFIP1 plays a dual role in two apparently unrelated processes, inhibiting local protein synthesis and favoring actin remodeling. Here, we show that brain-derived neurotrophic factor (BDNF)-driven synaptic signaling releases CYFIP1 from the translational inhibitory complex, triggering translation of target mRNAs and shifting CYFIP1 into the WAVE regulatory complex. Active Rac1 alters the CYFIP1 conformation, as demonstrated by intramolecular FRET, and is key in changing the equilibrium of the two complexes. CYFIP1 thus orchestrates the two molecular cascades, protein translation and actin polymerization, each of which is necessary for correct spine morphology in neurons. The CYFIP1 interactome reveals many interactors associated with brain disorders, opening new perspectives to define regulatory pathways shared by neurological disabilities characterized by spine dysmorphogenesis.

In this paper, the authors show that mice lacking Dlg genes each show distinct deficits in various learning paradigms. In addition, they find that humans with DLG2 mutations show similar cognitive deficits to their murine counterparts, suggesting an evolutionary conservation of function. The origins and evolution of higher cognitive functions, including complex forms of learning, attention and executive functions, are unknown. A potential mechanism driving the evolution of vertebrate cognition early in the vertebrate lineage (550 million years ago) was genome duplication and subsequent diversification of postsynaptic genes. Here we report, to our knowledge, the first genetic analysis of a vertebrate gene family in cognitive functions measured using computerized touchscreens. Comparison of mice carrying mutations in each of the four Dlg paralogs showed that simple associative learning required Dlg4, whereas Dlg2 and Dlg3 diversified to have opposing functions in complex cognitive processes. Exploiting the translational utility of touchscreens in humans and mice, testing Dlg2 mutations in both species showed that Dlg2's role in complex learning, cognitive flexibility and attention has been highly conserved over 100 million years. Dlg-family mutations underlie psychiatric disorders, suggesting that genome evolution expanded the complexity of vertebrate cognition at the cost of susceptibility to mental illness.

Abstract How is the information encoded within patterns of nerve impulses converted into diverse behavioral responses? To address this question, we conducted the largest genetic study to date of the electrophysiological and behavioral properties of synapses. Postsynaptic responses to elementary patterns of activity in the hippocampal CA1 region were measured in 58 lines of mice carrying mutations in the principal classes of excitatory postsynaptic proteins. A combinatorial molecular mechanism was identified in which distinct subsets of proteins amplified or attenuated responses across timescales from milliseconds to an hour. The same mechanism controlled the diversity and magnitude of innate and learned behavioral responses. PSD95 supercomplex proteins were central components of this synaptic machinery. The capacity of vertebrate synapses to compute activity patterns increased with genome evolution and is impaired by disease-relevant mutations. We propose that this species-conserved molecular mechanism converts the temporally encoded information in nerve impulses into the repertoire of innate and learned behavior.

Abstract Glutamatergic synapses form the vast majority of connections within neuronal circuits, but how these subcellular structures are molecularly organized within the mammalian brain is poorly understood. Conventional electron microscopy using chemically fixed, metal-stained tissue has identified a proteinaceous, membrane-associated thickening called the ‘postsynaptic density’ (PSD). Here, we combined mouse genetics and cryo-electron tomography to determine the 3D molecular architecture of fresh isolated and anatomically intact synapses in the adult forebrain. The native glutamatergic synapse did not consistently show a high density of proteins at the postsynaptic membrane thought to be characteristic of the PSD. Instead, a ‘synaptoplasm’ consisting of cytoskeletal elements, macromolecular complexes and membrane-bound organelles extended throughout the pre- and post-synaptic compartments. Snapshots of active processes gave insights into membrane remodeling processes. Clusters of 4-60 ionotropic glutamate receptors were positioned inside and outside the synaptic cleft. Together, these information-rich tomographic maps present a detailed molecular framework for the coordinated activity of synapses in the adult mammalian brain.

Increased levels of lactate, an end-product of glycolysis, have been proposed as a potential surrogate marker for metabolic changes during neuronal excitation. These changes in lactate levels can result in decreased brain pH, which has been implicated in patients with various neuropsychiatric disorders. We previously demonstrated that such alterations are commonly observed in five mouse models of schizophrenia, bipolar disorder, and autism, suggesting a shared endophenotype among these disorders rather than mere artifacts due to medications or agonal state. However, there is still limited research on this phenomenon in animal models, leaving its generality across other disease animal models uncertain. Moreover, the association between changes in brain lactate levels and specific behavioral abnormalities remains unclear. To address these gaps, the International Brain pH Project Consortium investigated brain pH and lactate levels in 109 strains/conditions of 2,294 animals with genetic and other experimental manipulations relevant to neuropsychiatric disorders. Systematic analysis revealed that decreased brain pH and increased lactate levels were common features observed in multiple models of depression, epilepsy, Alzheimer's disease, and some additional schizophrenia models. While certain autism models also exhibited decreased pH and increased lactate levels, others showed the opposite pattern, potentially reflecting subpopulations within the autism spectrum. Furthermore, utilizing large-scale behavioral test battery, a multivariate cross-validated prediction analysis demonstrated that poor working memory performance was predominantly associated with increased brain lactate levels. Importantly, this association was confirmed in an independent cohort of animal models. Collectively, these findings suggest that altered brain pH and lactate levels, which could be attributed to dysregulated excitation/inhibition balance, may serve as transdiagnostic endophenotypes of debilitating neuropsychiatric disorders characterized by cognitive impairment, irrespective of their beneficial or detrimental nature.

Abstract Neurodevelopmental disorders of genetic origin delay the acquisition of normal abilities and cause disabling phenotypes. Spontaneous attenuation and even complete amelioration of symptoms in early childhood and adolescence occur in many disorders 1–10 , suggesting that brain circuits possess an intrinsic capacity to repair themselves. We examined the molecular composition of almost a trillion excitatory synapses on a brain-wide scale between birth and adulthood in mice carrying a mutation in the homeobox transcription factor Pax6 , a neurodevelopmental disorder model 11 . Pax6 haploinsufficiency had no impact on total synapse number at any age. By contrast, the postnatal expansion of synapse diversity and acquisition of normal synaptome architecture were delayed in all brain regions, interfering with network and cognitive functions. Specific excitatory synapse types and subtypes were affected in two key developmental age-windows. These phenotypes were reversed within 2-3 weeks of onset, restoring synaptome architecture to its normal developmental trajectory. Synapse subtypes with high rates of protein turnover mediated these events. These results show synaptome remodelling confers resilience to neurodevelopmental disorders.

How synapses change molecularly during the lifespan and across all brain circuits is unknown. We analyzed the protein composition of billions of individual synapses from birth to old age on a brain-wide scale in the mouse, revealing a program of changes in the lifespan synaptome architecture spanning individual dendrites to the systems level. Three major phases were uncovered, corresponding to human childhood, adulthood and old age. An arching trajectory of synaptome architecture drives the differentiation and specialization of brain regions to a peak in young adults before dedifferentiation returns the brain to a juvenile state. This trajectory underscores changing network organization and hippocampal physiology that may account for lifespan transitions in intellectual ability and memory, and the onset of behavioral disorders.One sentence summary The synaptome architecture of the mouse brain undergoes continuous changes that organize brain circuitry across the lifespan.