A new engineered version of SpCas9, called HypaCas9, displays enhanced accuracy of editing without significant loss of efficiency at the desired target. One of the main concerns about the use of CRISPR in genomic editing is the possibility of 'off-target' events. Scientists have been modifying the central enzyme involved in CRISPR editing, Cas9 or its homologues, to reduce this unwanted property. Jennifer Doudna and colleagues describe a new version of this nuclease, HypaCas9, which enables more accurate editing, without substantial loss of efficiency on the desired target. The RNA-guided CRISPR–Cas9 nuclease from Streptococcus pyogenes (SpCas9) has been widely repurposed for genome editing1,2,3,4. High-fidelity (SpCas9-HF1) and enhanced specificity (eSpCas9(1.1)) variants exhibit substantially reduced off-target cleavage in human cells, but the mechanism of target discrimination and the potential to further improve fidelity are unknown5,6,7,8,9. Here, using single-molecule Förster resonance energy transfer experiments, we show that both SpCas9-HF1 and eSpCas9(1.1) are trapped in an inactive state10 when bound to mismatched targets. We find that a non-catalytic domain within Cas9, REC3, recognizes target complementarity and governs the HNH nuclease to regulate overall catalytic competence. Exploiting this observation, we design a new hyper-accurate Cas9 variant (HypaCas9) that demonstrates high genome-wide specificity without compromising on-target activity in human cells. These results offer a more comprehensive model to rationalize and modify the balance between target recognition and nuclease activation for precision genome editing.

On-target activities and genome-wide specificities of Cpf1 nucleases in human cells. The activities and genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases1 are not well defined. We show that two Cpf1 nucleases from Acidaminococcus sp. BV3L6 and Lachnospiraceae bacterium ND2006 (AsCpf1 and LbCpf1, respectively) have on-target efficiencies in human cells comparable with those of the widely used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)2,3,4,5. We also report that four to six bases at the 3′ end of the short CRISPR RNA (crRNA) used to program Cpf1 nucleases are insensitive to single base mismatches, but that many of the other bases in this region of the crRNA are highly sensitive to single or double substitutions. Using GUIDE-seq and targeted deep sequencing analyses performed with both Cpf1 nucleases, we were unable to detect off-target cleavage for more than half of 20 different crRNAs. Our results suggest that AsCpf1 and LbCpf1 are highly specific in human cells.

Broad use of CRISPR–Cas12a (formerly Cpf1) nucleases1 has been hindered by the requirement for an extended TTTV protospacer adjacent motif (PAM)2. To address this limitation, we engineered an enhanced Acidaminococcus sp. Cas12a variant (enAsCas12a) that has a substantially expanded targeting range, enabling targeting of many previously inaccessible PAMs. On average, enAsCas12a exhibits a twofold higher genome editing activity on sites with canonical TTTV PAMs compared to wild-type AsCas12a, and we successfully grafted a subset of mutations from enAsCas12a onto other previously described AsCas12a variants3 to enhance their activities. enAsCas12a improves the efficiency of multiplex gene editing, endogenous gene activation and C-to-T base editing, and we engineered a high-fidelity version of enAsCas12a (enAsCas12a-HF1) to reduce off-target effects. Both enAsCas12a and enAsCas12a-HF1 function in HEK293T and primary human T cells when delivered as ribonucleoprotein (RNP) complexes. Collectively, enAsCas12a provides an optimized version of Cas12a that should enable wider application of Cas12a enzymes for gene and epigenetic editing. Structure-guided protein engineering of Cas12a yields variants that have increased activity and that can edit sites with previously inaccessible PAMs.

CRISPR-Cas Cpf1 nucleases have recently been described as an alternative genome-editing platform, yet their activities and genome-wide specificities remain largely undefined. Here we show that two Cpf1 nucleases function robustly in human cells with on-target efficiencies comparable to those of the widely used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). We also demonstrate that four to six bases at the 3' end of the short CRISPR RNA (crRNA) used to program Cpf1 are insensitive to single base mismatches but that many of the other bases within the crRNA targeting region are highly sensitive to single or double substitutions. Consistent with these results, GUIDE-seq and targeted deep sequencing analyses of two Cpf1 nucleases revealed no detectable off-target cleavage for over half of 20 different crRNAs we examined. Our results suggest that the two Cpf1 nucleases we characterized generally possess high specificities in human cells, a finding that should encourage broader use of these genome editing enzymes.

The RNA-guided CRISPR-Cas9 nuclease from Streptococcus pyogenes (SpCas9) has been widely repurposed for genome editing. High-fidelity (SpCas9-HF1) and enhanced specificity (eSpCas9(1.1)) variants exhibit substantially reduced off-target cleavage in human cells, but the mechanism of target discrimination and the potential to further improve fidelity were unknown. Using single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) experiments, we show that both SpCas9-HF1 and eSpCas9(1.1) are trapped in an inactive state when bound to mismatched targets. We find that a non-catalytic domain within Cas9, REC3, recognizes target mismatches and governs the HNH nuclease to regulate overall catalytic competence. Exploiting this observation, we identified residues within REC3 involved in mismatch sensing and designed a new hyper-accurate Cas9 variant (HypaCas9) that retains robust on-target activity in human cells. These results offer a more comprehensive model to rationalize and modify the balance between target recognition and nuclease activation for precision genome editing.