Freshly isolated, resting natural killer (NK) cells are generally less lytic against target cells than in vitro interleukin 2 (IL-2)-activated NK cells. To investigate the basis for this difference, the contribution of several receptors to activation of human NK cells was examined. Target-cell lysis by IL-2-activated NK cells in a redirected, antibody-dependent cytotoxicity assay was triggered by a number of receptors. In contrast, cytotoxicity by resting NK cells was induced only by CD16, and not by NKp46, NKG2D, 2B4 (CD244), DNAM-1 (CD226), or CD2. Calcium flux in resting NK cells was induced with antibodies to CD16 and, to a weaker extent, antibodies to NKp46 and 2B4. Although NKp46 did not enhance CD16-mediated calcium flux, it synergized with all other receptors. 2B4 synergized with 3 other receptors, NKG2D and DNAM-1 each synergized with 2 other receptors, and CD2 synergized with NKp46 only. Resting NK cells were induced to secrete tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interferon gamma (IFN-gamma), and to kill target cells by engagement of specific, pair-wise combinations of receptors. Therefore, natural cytotoxicity by resting NK cells is induced only by mutual costimulation of nonactivating receptors. These results reveal distinct and specific patterns of synergy among receptors on resting NK cells.

The relative contribution to cytotoxicity of each of the multiple NK cell activation receptors has been difficult to assess. Using Drosophila insect cells, which express ligands of human NK cell receptors, we show that target cell lysis by resting NK cells is controlled by different receptor signals for cytolytic granule polarization and degranulation. Intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 on insect cells was sufficient to induce polarization of granules, but not degranulation, in resting NK cells. Conversely, engagement of the Fc receptor CD16 by rabbit IgG on insect cells induced degranulation without specific polarization. Lysis by resting NK cells occurred when polarization and degranulation were induced by the combined presence of ICAM-1 and IgG on insect cells. Engagement of receptor 2B4 by CD48 on insect cells induced weak polarization and no degranulation. However, coengagement of 2B4 and CD16 by their respective ligands resulted in granule polarization and cytotoxicity in the absence of leukocyte functional antigen-1-mediated adhesion to target cells. These data show that cytotoxicity by resting NK cells is controlled tightly by separate or cooperative signals from different receptors for granule polarization and degranulation.

Abstract Phenome-wide association studies (PheWAS), which assess whether a genetic variant is associated with multiple phenotypes across a phenotypic spectrum, have been proposed as a possible aid to drug development through elucidating mechanisms of action, identifying alternative indications, or predicting adverse drug events (ADEs). Here, we evaluate whether PheWAS can inform target validation during drug development. We selected 25 single nucleotide polymorphisms (SNPs) linked through genome-wide association studies (GWAS) to 19 candidate drug targets for common disease therapeutic indications. We independently interrogated these SNPs through PheWAS in four large “real-world data” cohorts (23andMe, UK Biobank, FINRISK, CHOP) for association with a total of 1,892 binary endpoints. We then conducted meta-analyses for 145 harmonized disease endpoints in up to 697,815 individuals and joined results with summary statistics from 57 published GWAS. Our analyses replicate 70% of known GWAS associations and identify 10 novel associations with study-wide significance after multiple test correction (P<1.8x10 -6 ; out of 72 novel associations with FDR<0.1). By leveraging directionality and point estimate of the effect sizes, we describe new associations that may predict ADEs, e.g., acne, high cholesterol, gout and gallstones for rs738409 (p.I148M) in PNPLA3 ; or asthma for rs1990760 (p.T946A) in IFIH1 . We further propose how quantitative estimates of genetic safety/efficacy profiles can be used to help prioritize candidate targets for a specific indication. Our results demonstrate PheWAS as a powerful addition to the toolkit for drug discovery. One Sentence Summary Matching genetics with phenotypes in 800,000 individuals predicts efficacy and on-target safety of future drugs.

Background: Single ventricle (SV) and hypoplastic left heart syndrome (HLHS) present significant sex differences in terms of surgical outcomes and long-term prognosis between male and female patients. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) drive tissue damage and cardiac dysfunction, contributing to the sex-specific clinical outcomes. Aims: We used single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) to assess gene expression profiles in PBMCs, aiming to gain insights into sex effects and identify new biomarkers for assessing disease prognosis. Methods: We studied PBMCs from 32 cases with SV/HLHS. The experiments were conducted in 3 independent batches (9 females/11 males; 2 females/6 males; 2 females/2 males), using 10X Chromium Single Cell Gene Expression assay (10x Genomics, Single Cell 3' v3). Sequencing was performed using the Illumina NovaSeq6000. The data analysis was conducted using the Seurat R package, employing SCTransform for data normalizing and scaling (Satija, Farrell et al. 2015, Butler, Hoffman et al. 2018). To mitigate batch effects, the 3 batches were analyzed separately. Results: 42 genes were consistently identified of differential expression (DE) (|log 2 FC|≥0.25, P adj<0.05) in each of the 3 batches, including 38 upregulated (6 on ChrX) and 4 downregulated genes in females. Notably, 3 autosome genes were also identified of DE in SV/HLHS cases compared to controls: PPP1R15A upregulated in cases has lower expression in females; EVL and CLEC2D downregulated in cases have higher expression in females. The expression of these 3 genes is more significant in naïve CD4 + T cells, CD14 + Monocytes, NK cells, and naïve B cells. Conclusion: PPP1R15A mediates cellular stress responses and apoptosis (Blais, Filipenko et al. 2004). EVL negatively regulates cell migration (Lambrechts, Kwiatkowski et al. 2000). CLEC2D mediates immune sensing of cell death through the recognition of histone sequences (Lai, Cruz et al. 2020). The expression changes in females may mitigate inflammation and immune dysregulation in SV/HLHS patients. The significance of these genes as prognostic markers and potential targets for therapeutic intervention in SV/HLHS management warrants further research.