Sequencing of pathogen DNA directly from clinical samples offers the possibilities of rapid diagnosis, faster antimicrobial resistance prediction and enhanced outbreak investigation. The approach is especially advantageous for infections caused by species which grow very slowly in culture, such as Mycobacteria tuberculosis. Since the pathogen of interest may represent as little as 0.01% of the total DNA, enrichment of the input material for target sequences by specific amplification and, or depletion of non-target DNA (human, other bacteria) is essential for success. Here, we investigated the potential of isothermal multiple displacement amplification by Phi29 polymerase. We directed the amplification reaction towards Mycobacteria DNA in sputum samples by exploiting in our oligonucleotide primer design, their high GC content (approximately 65%) relative to human DNA. Amplified DNA was then sequenced using the Oxford Nanopore Technology MinION. In addition, a model system comprising standardised ‘mock clinical samples’ was designed. Pooled infection negative human sputum samples were spiked with enumerated Mycobacterium bovis (BCG) Pasteur strain at concentrations spanning the typical range at which Mycobacterium tuberculosis is found in human sputum samples (106 - 101 BCG cells/ml). To assess the amount of BCG sequence enrichment achieved, sample DNA was sequenced both before, and after amplification. Reads from amplified samples, which mapped to a BCG reference genome, comprised short repeated sequences - apparently transcribed multiple times from the same fragment of BCG DNA. Therefore post-amplification, the samples were enriched for BCG sequences relative to unamplified sequences (8,101 BCG reference mapped reads, increasing to 28,617 at 106 BCG cells/ml sample), but BCG genome coverage declined markedly (for example 89.4% to 4.1%). In summary, the use of standardised mock clinical samples allowed direct comparison of data from different Mycobacteria enrichment experiments and sequencing runs. However, optimal conditions for multiple displacement amplification of minority Mycobacteria DNAs, remain to be identified.

Abstract Plasmids enable the dissemination of antimicrobial resistance (AMR) in common Enterobacterales pathogens, representing a major public health challenge. However, the extent of plasmid sharing and evolution between Enterobacterales causing human infections and other niches remains unclear, including the emergence of resistance plasmids. Dense, unselected sampling is highly relevant to developing our understanding of plasmid epidemiology and designing appropriate interventions to limit the emergence and dissemination of plasmid-associated AMR. We established a geographically and temporally restricted collection of human bloodstream infection (BSI)-associated, livestock-associated (cattle, pig, poultry, and sheep faeces, farm soils) and wastewater treatment work (WwTW)-associated (influent, effluent, waterways upstream/downstream of effluent outlets) Enterobacterales . Isolates were collected between 2008-2020 from sites <60km apart in Oxfordshire, UK. Pangenome analysis of plasmid clusters revealed shared “backbones”, with phylogenies suggesting an intertwined ecology where well-conserved plasmid backbones carry diverse accessory functions, including AMR genes. Many plasmid “backbones” were seen across species and niches, raising the possibility that plasmid movement between these followed by rapid accessory gene change could be relatively common. Overall, the signature of identical plasmid sharing is likely to be a highly transient one, implying that plasmid movement might be occurring at greater rates than previously estimated, raising a challenge for future genomic One Health studies. Funding This study was funded by the Antimicrobial Resistance Cross-council Initiative supported by the seven research councils and the NIHR, UK.

Background: The incidence of Escherichia coli bloodstream infections (EC-BSIs), particularly those caused by antibiotic-resistant strains, is increasing in the UK and internationally. This is a major public health concern but the evidence base to guide interventions is limited. Methods: Incidence of EC-BSIs and E. coli urinary tract infections (EC-UTIs) in one UK region (Oxfordshire) were estimated from anonymised linked microbiological and hospital electronic health records, and modelled using negative binomial regression based on microbiological, clinical and healthcare exposure risk factors. Infection severity, 30-day all-cause mortality, and community and hospital co-amoxiclav use were also investigated. Findings: From 1998-2016, 5706 EC-BSIs occurred in 5215 patients, and 228376 EC-UTIs in 137075 patients. 1365(24%) EC-BSIs were nosocomial (onset >48h post-admission), 1863(33%) were community (>365 days post-discharge), 1346(24%) were quasi-community (31-365 days post-discharge), and 1132(20%) were quasi-nosocomial (<=30 days post-discharge). 1413(20%) EC-BSIs and 36270(13%) EC-UTIs were co-amoxiclav-resistant (41% and 30%, respectively, in 2016). Increases in EC-BSIs were driven by increases in community (10%/year (95% CI:7%-13%)) and quasi-community (8%/year (95% CI:7%-10%)) cases. Changes in EC-BSI-associated 30-day mortality were at most modest (p>0.03), and mortality was substantial (14-25% across groups). By contrast, co-amoxiclav-resistant EC-BSIs increased in all groups (by 11%-19%/year, significantly faster than susceptible EC-BSIs, pheterogeneity<0.001), as did co-amoxiclav-resistant EC-UTIs (by 13%-29%/year, pheterogeneity<0.001). Co-amoxiclav use in primary-care facilities was associated with subsequent co-amoxiclav-resistant EC-UTIs (p=0.03) and all EC-UTIs (p=0.002). Interpretation: Current increases in EC-BSIs in Oxfordshire are primarily community-associated, with high rates of co-amoxiclav resistance, nevertheless not impacting mortality. Interventions should target primary-care facilities with high co-amoxiclav usage. Funding: National Institute for Health Research.

Routine full characterization of Mycobacterium tuberculosis (TB) is culture-based, taking many weeks. Whole-genome sequencing (WGS) can generate antibiotic susceptibility profiles to inform treatment, augmented with strain information for global surveillance; such data could be transformative if provided at or near point of care. We demonstrate a low-cost DNA extraction method for TB WGS direct from patient samples. We initially evaluated the method using the Illumina MiSeq sequencer (40 smear-positive respiratory samples, obtained after routine clinical testing, and 27 matched liquid cultures). M. tuberculosis was identified in all 39 samples from which DNA was successfully extracted. Sufficient data for antibiotic susceptibility prediction was obtained from 24 (62%) samples; all results were concordant with reference laboratory phenotypes. Phylogenetic placement was concordant between direct and cultured samples. Using an Illumina MiSeq/MiniSeq the workflow from patient sample to results can be completed in 44/16 hours at a cost of 96/198 GBP per sample. We then employed a non-specific PCR-based library preparation method for sequencing on an Oxford Nanopore Technologies MinION sequencer. We applied this to cultured Mycobacterium bovis BCG strain (BCG), and to combined culture-negative sputum DNA and BCG DNA. For the latest flowcell, the estimated turnaround time from patient to identification of BCG was 6 hours, with full susceptibility and surveillance results 2 hours later. Antibiotic susceptibility predictions were fully concordant. A critical advantage of the MinION is the ability to continue sequencing until sufficient coverage is obtained, providing a potential solution to the problem of variable amounts of M. tuberculosis in direct samples.

Resistance to amoxicillin-clavulanate, a widely used beta-lactam/beta-lactamase inhibitor combination antibiotic, is rising globally, yet susceptibility testing remains challenging. To test whether whole-genome sequencing (WGS) could provide a more reliable assessment of susceptibility than traditional methods, we predicted resistance from WGS for 976 E. coli bloodstream infection isolates from Oxfordshire, UK, comparing against phenotypes from the BD Phoenix (calibrated against EUCAST guidelines). 339/976 (35%) isolates were amoxicillin-clavulanate resistant. Predictions based solely on beta-lactamase presence/absence performed poorly (sensitivity 23% (78/339)) but improved when genetic features associated with penicillinase hyper-production (e.g. promoter mutations, copy number estimates) were considered (sensitivity 82% (277/339); p<0.0001). Most discrepancies occurred in isolates with peri-breakpoint MICs. We investigated two potential causes; the phenotypic reference and the binary resistant/susceptible classification. We performed reference standard, replicated phenotyping in a random stratified subsample of 261/976 (27%) isolates using agar dilution, following both EUCAST and CLSI guidelines, which use different clavulanate concentrations. As well as disagreeing with each other, neither agar dilution phenotype aligned perfectly with genetic features. A random-effects model investigating associations between genetic features and MICs showed that some genetic features had small, variable and additive effects, resulting in variable resistance classification. Using model fixed-effects to predict MICs for the non-agar dilution isolates, predicted MICs were in essential agreement (±1 doubling dilution) with observed (BD Phoenix) MICs for 691/715 (97%) isolates. This suggests amoxicillin-clavulanate resistance in E. coli is quantitative, rather than qualitative, explaining the poorly reproducible binary (resistant/susceptible) phenotypes and suboptimal concordance between different phenotypic methods and with WGS-based predictions.

Hybrid assemblies are highly valuable for studies of Enterobacteriaceae due to their ability to fully resolve the structure of mobile genetic elements, such as plasmids, which are involved in the carriage of clinically important genes (e.g. those involved in AMR/virulence). The widespread application of this technique is currently primarily limited by cost. Recent data has suggested that non-inferior, and even superior, hybrid assemblies can be produced using a fraction of the total output from a multiplexed nanopore (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) flowcell run. In this study we sought to determine the optimal minimal running time for flowcells when acquiring reads for hybrid assembly. We then evaluated whether the ONT wash kit might allow users to exploit shorter running times by sequencing multiple libraries per flowcell. After 24 hours of sequencing, most chromosomes and plasmids had circularised and there was no benefit associated with longer running times. Quality was similar at 12 hours suggesting shorter running times are likely to be acceptable for certain applications (e.g. plasmid genomics). The ONT wash kit was highly effective in removing DNA between libraries. Contamination between libraries did not appear to affect subsequent hybrid assemblies, even when the same barcodes were used successively on a single flowcell. Utilising shorter run-times in combination with between-library nuclease washes allows at least 36 Enterobacteriaceae isolates to be sequenced per flowcell, significantly reducing the per isolate sequencing cost. Ultimately this will facilitate large-scale studies utilising hybrid assembly advancing our understanding of the genomics of key human pathogens.

Mycobacterium tuberculosis (MTB) is the leading cause of death from bacterial infection. Improved rapid diagnosis and antimicrobial resistance determination, such as by whole genome sequencing, are required. Our aim was to develop a simple, low-cost method of preparing DNA for Oxford Nanopore Technologies (ONT) sequencing direct from MTB positive clinical samples (without culture). Simultaneous sputum liquefaction, bacteria heat-inactivation (99ºC/30min) and enrichment for Mycobacteria DNA was achieved using an equal volume of thermo-protection buffer (4M KCl, 0.05M HEPES buffer pH7.5, 0.1% DTT). The buffer emulated intracellular conditions found in hyperthermophiles, thus protecting DNA from rapid thermo-degradation, which renders it a poor template for sequencing. Initial validation employed Mycobacteria DNA (extracted or intracellular). Next, mock clinical samples (infection-negative human sputum spiked 0-105 BCG cells/ml) underwent liquefaction in thermo-protection buffer and heat-inactivation. DNA was extracted and sequenced. Human DNA degraded faster than Mycobacteria DNA, resulting in target enrichment. Four replicate experiments each demonstrated detection at 101 BCG cells/ml, with 31-59 MTB complex reads. Maximal genome coverage (>97% at 5x-depth) was achieved at 104 BCG cells/ml; >91% coverage (1x depth) at 103 BCG cells/ml. Final validation employed MTB positive clinical samples (n=20), revealed initial sample volumes ≥1ml typically yielded higher mean depth of MTB genome coverage, the overall range 0.55-81.02. A mean depth of 3 gave >96% one-fold TB genome coverage (in 15/20 clinical samples). A mean depth of 15 achieved >99% five-fold genome coverage (in 9/20 clinical samples). In summary, direct-from-sample sequencing of MTB genomes was facilitated by a low cost thermo-protection buffer.

Mycobacterium abscessus is emerging as an important pathogen in chronic lung diseases with concern regarding patient to patient transmission. The recent introduction of routine whole genome sequencing (WGS) as a replacement for existing reference techniques in England provides an opportunity to characterise the genetic determinants of resistance. We conducted a systematic review to catalogue all known resistance determining mutations. This knowledge was used to construct a predictive algorithm which was tested on a collection of 203 sequentially acquired clinical isolates for which there was paired genotype/phenotype data. A search for novel resistance determining mutations was conducted using an heuristic algorithm. The sensitivity of existing knowledge for predicting resistance in clarithromycin was 76.19% (95% CI 52.8 - 91.8%) and the specificity was 100%. Subspecies alone was a poor predictor of resistance to clarithromycin. Eight potential new resistance conferring SNPs were identified. WGS demonstrates probable resistance determining SNPs in regions the NTM-DR line probe cannot detect. These mutations are potentially clinically important as they all occurred in samples predicted to be inducibly resistant, and for which a macrolide would therefore currently be indicated. We were unable to explain all resistance, raising the possibility of the involvement of other as yet unidentified genes.

Influenza is a major global public health threat as a result of its highly pathogenic variants, large zoonotic reservoir, and pandemic potential. Metagenomic viral sequencing offers the potential of a diagnostic test for influenza which also provides insights on transmission, evolution and drug resistance, and simultaneously detects other viruses. We therefore set out to apply Oxford Nanopore Technology to metagenomic sequencing of respiratory samples. We generated influenza reads down to a limit of detection of 102-103 genome copies/ml in pooled samples, observing a strong relationship between the viral titre and the proportion of influenza reads (p = 4.7x10-5). Applying our methods to clinical throat swabs, we generated influenza reads for 27/27 samples with high-to-mid viral titres (Cycle threshold (Ct) values <30) and 6/13 samples with low viral titres (Ct values 30-40). No false positive reads were generated from 10 influenza-negative samples. Thus Nanopore sequencing operated with 83% sensitivity (95% CI 67-93%) and 100% specificity (95% CI 69-100%) compared to the current diagnostic standard. Coverage of full length virus was dependent on sample composition, being negatively influenced by increased host and bacterial reads. However, at high influenza titres, we were able to reconstruct >99% complete sequence for all eight gene segments. We also detected Human Coronavirus and generated a near complete Human Metapneumovirus genome from clinical samples. While further optimisation is required to improve sensitivity, this approach shows promise for the Nanopore platform to be used in the diagnosis and genetic analysis of influenza and other respiratory viruses.