Liquid-liquid phase separation (LLPS) of proteins and RNAs has emerged as the driving force underlying the formation of membrane-less organelles. Such biomolecular condensates have various biological functions and have been linked to disease. One of the best studied proteins undergoing LLPS is Fused in Sarcoma (FUS), a predominantly nuclear RNA-binding protein. Mutations in FUS have been causally linked to Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), an adult-onset motor neuron disease, and LLPS followed by aggregation of cytoplasmic FUS has been proposed to be a crucial disease mechanism. In spite of this, it is currently unclear how LLPS impacts the behaviour of FUS in cells, e.g. its interactome. In order to study the consequences of LLPS on FUS and its interaction partners, we developed a method that allows for the purification of phase separated FUS-containing droplets from cell lysates. We observe substantial alterations in the interactome of FUS, depending on its biophysical state. While non-phase separated FUS interacts mainly with its well-known interaction partners involved in pre-mRNA processing, phase-separated FUS predominantly binds to proteins involved in chromatin remodelling and DNA damage repair. Interestingly, factors with function in mitochondria are strongly enriched with phase-separated FUS, providing a potential explanation for early changes in mitochondrial gene expression observed in mouse models of ALS-FUS. In summary, we present a methodology that allows to investigate the interactome of phase-separating proteins and provide evidence that LLPS strongly shapes the FUS interactome with important implications for function and disease.

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as important effectors of the cellular DNA damage response (DDR). Implicated in RNA metabolism and DNA repair, the RBP Fused-in-sarcoma (FUS) contains a prion-like domain (PLD) and undergoes reversible phase separation. Here, we report that liquid-liquid phase separation (LLPS) occurs at DNA damage foci and is necessary for the efficient recruitment of key DDR factors. We show that FUS co-purifies with the DDR factor KU and with SFPQ, another PLD-containing RBP implicated in DNA repair. Moreover, we demonstrate that FUS is required for 53BP1 localisation to DNA damage foci and for the correct recruitment of KU80 and NBS1 to sites of DNA damage. LLPS-deficient FUS variants impair retention of the DNA damage sensor KU at sites of DNA damage, and the recruitment of SFPQ. These findings provide a mechanistic function for FUS-dependent LLPS in the activation of the DDR and in the recruitment of DDR factors and RBPs at sites of DNA damage.

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as important effectors of the cellular DNA damage response (DDR). The RBP FUS is implicated in RNA metabolism and DNA repair, and it undergoes reversible liquid-liquid phase separation (LLPS) in vitro. Here, we demonstrate that FUS-dependent LLPS is necessary for the initiation of the DDR. Using laser microirradiation in FUS-knockout cells, we show that FUS is required for the recruitment to DNA damage sites of the DDR factors KU80, NBS1, 53BP1, and of SFPQ, another RBP implicated in the DDR. The relocation of KU80, NBS1, and SFPQ is similarly impaired by LLPS inhibitors, or LLPS-deficient FUS variants. We also show that LLPS is necessary for efficient γH2AX foci formation. Finally, using super-resolution structured illumination microscopy, we demonstrate that the absence of FUS impairs the proper arrangement of γH2AX nano-foci into higher-order clusters. These findings demonstrate the early requirement for FUS-dependent LLPS in the activation of the DDR and the proper assembly of DSBs repair complexes.

Abstract Mutations in the RNA/DNA-binding proteins FUS and TDP-43 cause amyotrophic lateral sclerosis (ALS) with distinct neuropathological features. It is currently unclear how these gene mutations lead to selective motor neuron death and if there are common mechanisms across disease causations. Using single cell RNA sequencing of neurons derived from isogenic induced pluripotent stem cell lines, we demonstrate that motor neurons harbouring FUS P525L or FUS R495X mutations show a 4.9- to 15.5-fold larger transcriptional response than interneurons. About 20% of transcripts were coregulated across FUS mutations in motor neurons and about half of these were caused by FUS gain-of-function. Comparison with TDP-43 M337V motor neurons, identified common mitochondrial dysfunction across gene mutations. Metabolic assessment confirmed a decrease in mitochondrial respiration and ATP turnover in mutant FUS and TARDBP motor neurons and live cell microscopy revealed impaired mitochondrial motility across ALS motor axons. Thus, we have identified early mitochondrial dysfunction in motor neurons shared across ALS-causative mutations, that could have major implications for their survival and which could be targeted therapeutically.