Abstract Jasmonates (JAs) trigger an important transcriptional reprogramming of plant cells to modulate both basal development and stress responses. In spite of the importance of transcriptional regulation, only one transcription factor (TF), the Arabidopsis thaliana basic helix-loop-helix MYC2, has been described so far as a direct target of JAZ repressors. By means of yeast two-hybrid screening and tandem affinity purification strategies, we identified two previously unknown targets of JAZ repressors, the TFs MYC3 and MYC4, phylogenetically closely related to MYC2. We show that MYC3 and MYC4 interact in vitro and in vivo with JAZ repressors and also form homo- and heterodimers with MYC2 and among themselves. They both are nuclear proteins that bind DNA with sequence specificity similar to that of MYC2. Loss-of-function mutations in any of these two TFs impair full responsiveness to JA and enhance the JA insensitivity of myc2 mutants. Moreover, the triple mutant myc2 myc3 myc4 is as impaired as coi1-1 in the activation of several, but not all, JA-mediated responses such as the defense against bacterial pathogens and insect herbivory. Our results show that MYC3 and MYC4 are activators of JA-regulated programs that act additively with MYC2 to regulate specifically different subsets of the JA-dependent transcriptional response.

The plant hormone jasmonic acid (JA) regulates growth, development and defence responses against pathogens. Recently, a family of proteins called JAZ that repress JA responses were identified, but the mechanism by which they repress gene expression was unknown. Pauwels et al. identify an adaptor protein, designated Novel Interactor of JAZ (NINJA), that recruits co-repressor proteins, TOPLESS (TPL) and TPL-related proteins (TPRs), which are known to mediate auxin-responsive gene expression. These results suggest that TPL and related proteins are part of general repression complexes, which are recruited to multiple signalling pathways. In plants, the hormone jasmonoyl-isoleucine (JA-Ile) regulates growth, development and defence against pathogens. Proteins of the JAZ family repress JA-Ile-dependent gene expression, but the mechanism has been unclear. Here, an adaptor protein, NINJA, has been identified, which recruits co-repressor proteins that are known to mediate auxin-responsive gene expression as well. Hence these co-repressors are part of general repression complexes that are recruited to several different signalling pathways. Jasmonoyl-isoleucine (JA-Ile) is a plant hormone that regulates a broad array of plant defence and developmental processes1,2,3,4,5. JA-Ile-responsive gene expression is regulated by the transcriptional activator MYC2 that interacts physically with the jasmonate ZIM-domain (JAZ) repressor proteins. On perception of JA-Ile, JAZ proteins are degraded and JA-Ile-dependent gene expression is activated6,7. The molecular mechanisms by which JAZ proteins repress gene expression remain unknown. Here we show that the Arabidopsis JAZ proteins recruit the Groucho/Tup1-type co-repressor TOPLESS (TPL)8 and TPL-related proteins (TPRs) through a previously uncharacterized adaptor protein, designated Novel Interactor of JAZ (NINJA). NINJA acts as a transcriptional repressor whose activity is mediated by a functional TPL-binding EAR repression motif. Accordingly, both NINJA and TPL proteins function as negative regulators of jasmonate responses. Our results point to TPL proteins as general co-repressors that affect multiple signalling pathways through the interaction with specific adaptor proteins. This new insight reveals how stress-related and growth-related signalling cascades use common molecular mechanisms to regulate gene expression in plants.

Plant specialized metabolites have ecological functions, yet the presence of numerous uncharacterized biosynthetic genes in plant genomes suggests that many molecules remain unknown. We discovered a triterpene biosynthetic network in the roots of the small mustard plant Arabidopsis thaliana. Collectively, we have elucidated and reconstituted three divergent pathways for the biosynthesis of root triterpenes, namely thalianin (seven steps), thalianyl medium-chain fatty acid esters (three steps), and arabidin (five steps). A. thaliana mutants disrupted in the biosynthesis of these compounds have altered root microbiota. In vitro bioassays with purified compounds reveal selective growth modulation activities of pathway metabolites toward root microbiota members and their biochemical transformation and utilization by bacteria, supporting a role for this biosynthetic network in shaping an Arabidopsis-specific root microbial community.

The (seco)iridoids and their derivatives, the monoterpenoid indole alkaloids (MIAs), form two large families of plant-derived bioactive compounds with a wide spectrum of high-value pharmacological and insect-repellent activities. Vinblastine and vincristine, MIAs used as anticancer drugs, are produced by Catharanthus roseus in extremely low levels, leading to high market prices and poor availability. Their biotechnological production is hampered by the fragmentary knowledge of their biosynthesis. Here we report the discovery of the last four missing steps of the (seco)iridoid biosynthesis pathway. Expression of the eight genes encoding this pathway, together with two genes boosting precursor formation and two downstream alkaloid biosynthesis genes, in an alternative plant host, allows the heterologous production of the complex MIA strictosidine. This confirms the functionality of all enzymes of the pathway and highlights their utility for synthetic biology programmes towards a sustainable biotechnological production of valuable (seco)iridoids and alkaloids with pharmaceutical and agricultural applications.

Recovery of testicular spermatozoa from azoospermic patients with testicular failure followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a recent advance in the treatment of male infertility. This study aimed at investigating which parameter(s) may predict successful testicular sperm recovery. We reviewed 395 testicular sperm recovery procedures and analysed the most frequently available parameters for clinical decision-making in azoospermic patients: (i) presence of at least one single spermatozoon in at least one preliminary semen analysis; (ii) maximum testicular volume; (iii) serum follicle stimulating hormone (FSH); and (iv) presence of spermatozoa in the histology of a randomly-taken testicular biopsy. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive value, positive and negative likelihood ratio and accuracy were calculated for the above index parameters in different clinically relevant subgroups using receiver operating characteristic (ROC) curves whenever possible. Spermatozoa were always successfully recovered in patients with normal testicular histological findings (n = 173) or hypospermatogenesis (n = 16) but not in some patients with tubular sclerosis (seven out of 18), Sertoli cell-only pattern (55 out of 112) or maturation arrest (39 out of 76). Histopathology was the best test for predicting successful sperm recovery in the whole population (sensitivity: 86%, specificity: 93%, accuracy: 0.87). In patients with secretory azoospermia, histopathology was again the most accurate parameter (accuracy: 0.74), especially in patients showing Sertoli cell-only pattern (accuracy: 0.83) but not in patients showing maturation arrest (accuracy: 0.55). In patients with serum FSH concentrations > 12 IU/l and maximum testicular volume < 15 ml, histopathology was not found to be accurate. Semen analysis, maximum testicular volume and serum FSH were not highly predictive in all subgroups studied. Our analysis shows that no strong predictors for successful testicular sperm recovery are available except for testicular histopathology.

Jasmonates (JAs) are plant-specific signaling molecules that steer a diverse set of physiological and developmental processes. Pathogen attack and wounding inflicted by herbivores induce the biosynthesis of these hormones, triggering defense responses both locally and systemically. We report on alterations in the transcriptome of a fast-dividing cell culture of the model plant Arabidopsis thaliana after exogenous application of methyl JA (MeJA). Early MeJA response genes encoded the JA biosynthesis pathway proteins and key regulators of MeJA responses, including most JA ZIM domain proteins and MYC2, together with transcriptional regulators with potential, but yet unknown, functions in MeJA signaling. In a second transcriptional wave, MeJA reprogrammed cellular metabolism and cell cycle progression. Up-regulation of the monolignol biosynthesis gene set resulted in an increased production of monolignols and oligolignols, the building blocks of lignin. Simultaneously, MeJA repressed activation of M-phase genes, arresting the cell cycle in G 2 . MeJA-responsive transcription factors were screened for their involvement in early signaling events, in particular the regulation of JA biosynthesis. Parallel screens based on yeast one-hybrid and transient transactivation assays identified both positive (MYC2 and the AP2/ERF factor ORA47) and negative (the C2H2 Zn finger proteins STZ/ZAT10 and AZF2) regulators, revealing a complex control of the JA autoregulatory loop and possibly other MeJA-mediated downstream processes.

Despite the tremendous importance of secondary metabolites for humans as for the plant itself, plant secondary metabolism remains poorly characterized. Here, we present an experimental approach, based on functional genomics, to facilitate gene discovery in plant secondary metabolism. Targeted metabolite analysis was combined with cDNA-amplified fragment length polymorphism-based transcript profiling of jasmonate-elicited tobacco Bright yellow 2 cells. Transcriptome analysis suggested an extensive jasmonate-mediated genetic reprogramming of metabolism, which correlated well with the observed shifts in the biosynthesis of the metabolites investigated. This method, which in addition to transcriptome data also generates gene tags, in the future might lead to the creation of novel tools for metabolic engineering of medicinal plant systems in general.

Antagonism between the defense hormones salicylic acid (SA) and jasmonic acid (JA) plays a central role in the modulation of the plant immune signaling network, but the molecular mechanisms underlying this phenomenon are largely unknown. Here, we demonstrate that suppression of the JA pathway by SA functions downstream of the E3 ubiquitin-ligase Skip-Cullin-F-box complex SCF(COI1), which targets JASMONATE ZIM-domain transcriptional repressor proteins (JAZs) for proteasome-mediated degradation. In addition, neither the stability nor the JA-induced degradation of JAZs was affected by SA. In silico promoter analysis of the SA/JA crosstalk transcriptome revealed that the 1-kb promoter regions of JA-responsive genes that are suppressed by SA are significantly enriched in the JA-responsive GCC-box motifs. Using GCC:GUS lines carrying four copies of the GCC-box fused to the β-glucuronidase reporter gene, we showed that the GCC-box motif is sufficient for SA-mediated suppression of JA-responsive gene expression. Using plants overexpressing the GCC-box binding APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR (AP2/ERF) transcription factors ERF1 or ORA59, we found that SA strongly reduces the accumulation of ORA59 but not that of ERF1. Collectively, these data indicate that the SA pathway inhibits JA signaling downstream of the SCF(COI1)-JAZ complex by targeting GCC-box motifs in JA-responsive promoters via a negative effect on the transcriptional activator ORA59.

Rational engineering of complicated metabolic networks involved in the production of biologically active plant compounds has been greatly impeded by our poor understanding of the regulatory and metabolic pathways underlying the biosynthesis of these compounds. Whereas comprehensive genome-wide functional genomics approaches can be successfully applied to analyze a select number of model plants, these holistic approaches are not yet available for the study of nonmodel plants that include most, if not all, medicinal plants. We report here a comprehensive profiling analysis of the Madagascar periwinkle (Catharanthus roseus), a source of the anticancer drugs vinblastine and vincristine. Genome-wide transcript profiling by cDNA-amplified fragment-length polymorphism combined with metabolic profiling of elicited C. roseus cell cultures yielded a collection of known and previously undescribed transcript tags and metabolites associated with terpenoid indole alkaloids. Previously undescribed gene-to-gene and gene-to-metabolite networks were drawn up by searching for correlations between the expression profiles of 417 gene tags and the accumulation profiles of 178 metabolite peaks. These networks revealed that the different branches of terpenoid indole alkaloid biosynthesis and various other metabolic pathways are subject to differing hormonal regulation. These networks also served to identify a select number of genes and metabolites likely to be involved in the biosynthesis of terpenoid indole alkaloids. This study provides the basis for a better understanding of periwinkle secondary metabolism and increases the practical potential of metabolic engineering of this important medicinal plant.

At some point during biosynthesis of the antimalarial artemisinin in glandular trichomes of Artemisia annua, the Δ11(13) double bond originating in amorpha-4,11-diene is reduced. This is thought to occur in artemisinic aldehyde, but other intermediates have been suggested. In an effort to understand double bond reduction in artemisinin biosynthesis, extracts of A. annua flower buds were investigated and found to contain artemisinic aldehyde Δ11(13) double bond reductase activity. Through a combination of partial protein purification, mass spectrometry, and expressed sequence tag analysis, a cDNA clone corresponding to the enzyme was isolated. The corresponding gene Dbr2, encoding a member of the enoate reductase family with similarity to plant 12-oxophytodienoate reductases, was found to be highly expressed in glandular trichomes. Recombinant Dbr2 was subsequently characterized and shown to be relatively specific for artemisinic aldehyde and to have some activity on small α,β-unsaturated carbonyl compounds. Expression in yeast of Dbr2 and genes encoding four other enzymes in the artemisinin pathway resulted in the accumulation of dihydroartemsinic acid. The relevance of Dbr2 to trichome-specific artemisinin biosynthesis is discussed. At some point during biosynthesis of the antimalarial artemisinin in glandular trichomes of Artemisia annua, the Δ11(13) double bond originating in amorpha-4,11-diene is reduced. This is thought to occur in artemisinic aldehyde, but other intermediates have been suggested. In an effort to understand double bond reduction in artemisinin biosynthesis, extracts of A. annua flower buds were investigated and found to contain artemisinic aldehyde Δ11(13) double bond reductase activity. Through a combination of partial protein purification, mass spectrometry, and expressed sequence tag analysis, a cDNA clone corresponding to the enzyme was isolated. The corresponding gene Dbr2, encoding a member of the enoate reductase family with similarity to plant 12-oxophytodienoate reductases, was found to be highly expressed in glandular trichomes. Recombinant Dbr2 was subsequently characterized and shown to be relatively specific for artemisinic aldehyde and to have some activity on small α,β-unsaturated carbonyl compounds. Expression in yeast of Dbr2 and genes encoding four other enzymes in the artemisinin pathway resulted in the accumulation of dihydroartemsinic acid. The relevance of Dbr2 to trichome-specific artemisinin biosynthesis is discussed. Since its discovery in the 1970s (1Liu J.-M. Ni M.-Y. Fan J. -F. Tu Y. -Y. Wu Z. -H. Wu Y. -L. Chou W.-S. Acta Chim. Sin. 1979; 37: 129-143Google Scholar), the sesquiterpene lactone artemisinin (Fig. 1) from Artemisia annua has become a key factor in the drive to control malaria (2Mutabingwa T.K. Acta Trop. 2005; 95: 305-315Crossref PubMed Scopus (236) Google Scholar, 3Rathore D. McCutchan T.F. Sullivan M. Kumar S. Expert Opin. Investig. Drugs. 2005; 14: 871-883Crossref PubMed Scopus (52) Google Scholar, 4Haynes R.K. Curr. Top. Med. Chem. 2006; 6: 509-537Crossref PubMed Scopus (206) Google Scholar). Semi-synthetic derivatives of plant-derived artemisinin form the basis for artemisinin-based combination therapies, which are the treatment of choice for most forms of the disease. Given the pharmaceutical importance of artemisinin and its singular plant source, there is considerable interest in maintaining a reliable and low cost supply (5Kindermans J.M. Pilloy J. Olliaro P. Gomes M. Malar. J. 2007; 6: 125Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). A more complete knowledge of artemisinin biosynthesis and the genes involved is likely to provide ways of increasing production and lowering cost through crop improvement or microbial engineering (6Covello P.S. Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Phytochemistry. 2007; 68: 1864-1871Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar, 7Zeng Q. Qiu F. Yuan L. Biotechnol. Lett. 2008; 30: 581-592Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar). As in other members of the Asteraceae, A. annua has 10-celled biseriate glandular trichomes that appear on the surfaces of aerial parts of the plant (8Wagner G.J. Wang E. Shepherd R.W. Ann. Bot. (Lond.). 2004; 93: 3-11Crossref PubMed Scopus (421) Google Scholar, 9Ferreira J.F.S. Simon J.E. Janick J. Hort. Rev. 1997; 19: 319-371Google Scholar, 10Duke S.O. Paul R.N. Int. J. Plant Sci. 1993; 154: 107-118Crossref Google Scholar). Along with other isoprenoids, the sesquiterpene lactone artemisinin accumulates to levels of 0.01–2% dry weight (11Duke M.V. Paul R.N. Elsohly H.N. Sturtz G. Duke S.O. Int. J. Plant Sci. 1994; 155: 365-372Crossref Scopus (224) Google Scholar). Although progress is being made in understanding the biosynthesis of artemisinin, considerable gaps in our knowledge remain (6Covello P.S. Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Phytochemistry. 2007; 68: 1864-1871Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar, 12Bertea C.M. Freije J.R. Van der Woude H. Verstappen F.W. Perk L. Marquez V. de Kraker J.W. Posthumus M.A. Jansen B.J. de Groot A. Franssen M.C. Bouwmeester H.J. Planta Med. 2005; 71: 40-47Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar). The formation of amorpha-4,11-diene by amorpha-4,11-diene synthase is the first committed step in the pathway. This is followed by oxidation at C-12 of amorpha-4,11-diene by the cytochrome P-450, Cyp71av1 to give artemisinic alcohol. These steps are well supported from biochemical studies and by the molecular cloning of genes encoding the relevant enzymes (12Bertea C.M. Freije J.R. Van der Woude H. Verstappen F.W. Perk L. Marquez V. de Kraker J.W. Posthumus M.A. Jansen B.J. de Groot A. Franssen M.C. Bouwmeester H.J. Planta Med. 2005; 71: 40-47Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar, 13Chang Y.J. Song S.H. Park S.H. Kim S.U. Arch. Biochem. Biophys. 2000; 383: 178-184Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar, 14Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Covello P.S. FEBS Lett. 2006; 580: 1411-1416Crossref PubMed Scopus (334) Google Scholar). The pathway beyond artemisinic alcohol is somewhat less well established (6Covello P.S. Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Phytochemistry. 2007; 68: 1864-1871Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar, 7Zeng Q. Qiu F. Yuan L. Biotechnol. Lett. 2008; 30: 581-592Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar, 15Li Y. Huang H. Wu Y.-L Liang X-T. Fang W.-S. Medicinal Chemistry of Bioactive Natural Products. John Wiley & Sons, Inc., New York2006: 183-256Google Scholar). However, there is biochemical evidence supporting a route to dihydroartemsinic acid via artemisinic aldehyde and dihydroartemsinic aldehyde (12Bertea C.M. Freije J.R. Van der Woude H. Verstappen F.W. Perk L. Marquez V. de Kraker J.W. Posthumus M.A. Jansen B.J. de Groot A. Franssen M.C. Bouwmeester H.J. Planta Med. 2005; 71: 40-47Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar). This route includes the proposed reduction of the Δ11(13) double bond of artemisinic aldehyde (Fig. 1). Artemisinin per se appears to be derived from dihydroartemisinic acid in a series of reactions that may not be enzyme-dependent (16Brown G.D. Sy L.-K Tetrahedron. 2004; 60: 1139-1159Crossref Scopus (134) Google Scholar, 17Sy L.K. Brown G.D. Tetrahedron. 2002; 58: 897-908Crossref Scopus (114) Google Scholar). Alternatively, based on labeling studies, artemisinic acid and derivatives, such as arteannuin B and artemisitene, have been suggested as precursors to artemisinin (6Covello P.S. Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Phytochemistry. 2007; 68: 1864-1871Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar, 7Zeng Q. Qiu F. Yuan L. Biotechnol. Lett. 2008; 30: 581-592Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar, 15Li Y. Huang H. Wu Y.-L Liang X-T. Fang W.-S. Medicinal Chemistry of Bioactive Natural Products. John Wiley & Sons, Inc., New York2006: 183-256Google Scholar). Clearly, a more detailed knowledge of the biochemistry of Δ11(13) double bond reduction during artemisinin formation is important in differentiating the proposed routes, which can be considered “early” and “late” reduction pathways. As part of an effort to understand the isoprenoid metabolism in glandular trichomes of the A. annua L., we have undertaken an expressed sequence tag (EST)-based 4The abbreviations used are: EST, expressed sequence tag; AA, artemisinic acid; Ads, amorpha-4,11-diene synthase; AtOPR, A. thaliana 12-oxophytodienoate reductase; Cpr, A. annua cytochrome P-450 reductase; Cyp71av1, amorpha-4;11-diene monooxygenase; Dbr2, artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase; Fps2, A. annua farnesyl diphosphate synthase; GC/MS, gas chromatography/mass spectrometry; MES, 4-morpholineethanesulfonic acid; RT, reverse transcription; GFP, green fluorescent protein; OPR, 12-oxophytodienoate reductase; OYE, old yellow enzyme. approach to identify relevant genes (6Covello P.S. Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Phytochemistry. 2007; 68: 1864-1871Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar, 14Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Covello P.S. FEBS Lett. 2006; 580: 1411-1416Crossref PubMed Scopus (334) Google Scholar). This led to the identification of Cyp71av1, a multifunctional cytochrome P-450 capable of multiple oxidations of amorpha-4,11-diene. In a continuation of our investigation of the enzymes involved in artemisinin biosynthesis, we report here on the combined use of enzyme purification, mass spectrometry, and EST analysis leading to the molecular cloning and characterization of a sesquiterpenoid double bond reductase from A. annua. The characterization of this enzyme provides important support for the early Δ11(13) reduction in artemisinin biosynthesis. Plant Materials—A. annua seeds were obtained from Pedro Melillo de Magalhães (State University of Campinas, Brazil; line 2/39). The A. annua 2/39 line is characterized as a high artemisinin chemotype with a characteristically high dihydroartemisinic acid to artemisinic acid ratio (∼20:1 in flower buds; data not shown) (18Wallaart T.E. Pras N. Beekman A.C. Quax W.J. Planta Med. 2000; 66: 57-62Crossref PubMed Scopus (215) Google Scholar). The seeds were germinated and grown in soil in a controlled environment chamber with 16-h 24 °C days and 8-h 21 °C nights. Plants that had reached the height of ∼1.2 m (after about 3 months) were transferred to a flowering chamber with 8-h 24 °C days and 16-h 21 °C nights. Roots, leaves (mixtures of upper, middle, and lower leaves), and flower buds (27–29 days after flower induction under short days) were harvested and stored at -80 °C for subsequent RNA isolations and enzyme assays. Glandular trichomes were prepared from flower buds as described previously (14Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Covello P.S. FEBS Lett. 2006; 580: 1411-1416Crossref PubMed Scopus (334) Google Scholar). Chemicals—Artemisinin, pyridinium chlorochromate, coniferyl aldehyde, 2-cyclohexen-1-one, 2E-hexenal, hexanal, 2E-nonenal, nonanal, (+)-α-pinene, and (+)-pulegone were obtained from Aldrich, and (+)-carvone, cyclohexanone, dihydrocarvone were obtained from Sigma. 12-Oxophytodienoic acid was obtained from Cedarlane Laboratories (Burlington, Canada). Arteannuin B and artemisitene were kindly provided by Dieter Deforce (University of Ghent). Artemisinic alcohol preparation was described previously (14Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Covello P.S. FEBS Lett. 2006; 580: 1411-1416Crossref PubMed Scopus (334) Google Scholar). Sabinone was synthesized from sabinyl acetate obtained from the Plant Biotechnology Institute terpene collection (19von Rudloff E. Can J. Chem. 1963; 41: 2876-2881Crossref Google Scholar) by saponification of the sabinyl acetate to d-sabinol followed by oxidation of the alcohol using pyridinium chlorochromate (20Corey E.J. Suggs J.W. Tetrahedron Lett. 1975; 16: 2647-2650Crossref Scopus (2701) Google Scholar). The product was verified by mass spectral analysis. Isolation and/or semi-synthesis of artemisinic acid and artemisinic aldehyde, dihydroartemisinic acid, and three preparations containing dihydroartemisinic aldehyde epimers were prepared as described in the supplemental data. GC/MS Analysis—GC/MS analyses were performed on an Agilent 6890N gas chromatograph coupled to an Agilent 5973N mass selective detector in electron impact mode (70 eV) with either an InnoWax column (30-m × 0.25-mm inner diameter; Agilent) for sesquiterpenoid analysis or a DB-5 column (30-m × 0.25-mm inner diameter; J & W Scientific) for other compounds analyzed. The InnoWax column was temperature-programmed from 125 to 300 °C at 5 °C min-1; the DB-5 column was programmed at an initial temperature of 40 °C for 5 min and then increased to 240 °C at 5 °C min-1. GC/MS analysis of reductase assays using arteannuin B and artemisitene was accomplished using a short DB-5 column (10-m × 0.25-mm inner diameter; Agilent) with all heated zones set to <150 °C to prevent thermal decomposition of any heat labile compounds (including artemisinin) and an oven temperature program of 120–150 °C at 2 °C min-1. Under these conditions no degradation of a standard of artemisinin was detected. Reductase Assays—Unless otherwise stated, double bond reductase assays were carried out as follows. The reactions were initiated by adding 0.5 mm substrate to a 300-μl reaction mixture containing 50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 1 mm NADPH, 2 mm dithiothreitol, and various amounts of enzyme preparation. Protein in enzyme preparations was quantified by Bio-Rad protein assay. Negative controls were carried out with boiled proteins and without NADPH. The reactions were allowed to proceed for 30 min at 30 °C with shaking (500 rpm), stopped by adding 15 μl of glacial acetic acid, and extracted with 150 μl ethyl acetate. The ethyl acetate extracts were used directly for GC/MS analysis. The reaction products were confirmed by comparing GC retention time and MS data with those of standards. For quantitation, 3 μg of octadecane was used as an internal standard. For details of the reductase measurements in plant tissues, the partial purification of the reductase, and related protein MS, see the supplemental data. Phylogenetic Analysis—Phylogenetic analysis of selected amino acid sequences showing similarity to Dbr2 was performed as described previously (21Meesapyodsuk D. Reed D.W. Covello P.S. Qiu X. J. Biol. Chem. 2007; 282: 20191-20199Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (47) Google Scholar). Characterization of Recombinant Artemisinic Aldehyde Δ11(13) Reductase—Recombinant Dbr2 was prepared as described in the supplemental data. For characterization of the enzyme, the reaction mixtures were prewarmed to 30 °C, and the reactions were initiated by addition of Dbr2. The pH optimum of the purified Dbr2 was determined to be 7.5 in assay that included one of three 50 mm buffers (MES, HEPES, and Tris-HCl) adjusted to between pH 5.5 and 9.0 in 0.5-unit intervals and 0.5 mm artemisinic aldehyde and 0.48 μg of purified recombinant Dbr2. Apparent kinetic parameters were determined under conditions that limited conversion to less than 10% as follows. Concentrations of artemisinic aldehyde (6–250 μm; 0.24 μg of Dbr2, 2 min), 2-cyclohexen-1-one (80–10,000 μm; 0.48 μg of Dbr2; 10 min), and (+)-carvone (20–5000 μm; 0.48 μg Dbr2; 10 min) were varied in the presence of 1 mm NADPH. To assess cofactor specificity, concentrations of NADPH (10–640 μm; 0.48 μg of Dbr2, 2 min) and NADH (0.2–13 mm; 1.9 μg of Dbr2; 2 min) were varied in the presence of 0.5 mm artemisinic aldehyde. The ethyl acetate extracts from triplicate reaction mixtures were directly analyzed by GC/MS. Octadecane was used as an internal standard to quantify the products formed from the reactions using response factors determined using standards for each enzyme product. The Km and kcat values were determined by nonlinear regression analysis using GraphPad software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). RNA Isolation and Gene Expression Analysis—Total RNA was extracted from plant tissues using a RNeasy Plant RNA isolation kit (Qiagen). For quantitative RT-PCR analysis of Dbr2 expression, first strand cDNA was prepared using Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen) using 2 μg of total RNA as the template. Quantitative RT-PCR was performed using a MX3005P Cycler (Stratagene) with a SYBR® GreenER qPCR SuperMix Universal kit (Invitrogen). The thermal cycling conditions were as follows: 50 °C for 2 min, 95 °C for 4 min, followed by 40 cycles of 95 °C for 30 s, 58 °C for 1 min, and 72 °C for 40 s, and one cycle of 95 °C for 1 min, 55 °C for 30 s, and 95 °C for 30 s. The primers 5′-CTTGGGTTACAAGCTGTGGCTCAAG-3′ and 5′-ATATAATCAAAACTAGAGGAGTGAC C-3′ were used to amplify a 209-bp fragment of the Dbr2 transcript. The primers 5′-CCAGCAGCTTCCATTCCGAT-3′ and 5′-CGCCATCCTTCGTTTGGACT-3′ were used to amplify a 300-bp fragment of a gene named A. annua Actin1 by the authors. These were designed based on the sequence of a cDNA fragment corresponding to A. annua Actin1 cloned from an RT-PCR product using the degenerate primers 5′-AGCAACTGGGATGACATGGAG-3′ and 5′-CACCTTCGATCTTCATGCTG-3′ and A. annua leaf cDNA. Subcellular Localization of Dbr2—To investigate the subcellular localization of artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase, Dbr2 and Arabidopsis thaliana Opr3 were introduced into the vector pER420. The vector pER420, obtained from Raju Datla (Plant Biotechnology Institute), was derived from pK7WG2 (22Karimi M. Inze D. Depicker A. Trends Plant Sci. 2002; 7: 193-195Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2727) Google Scholar) by the introduction of a sequence encoding smGFP immediately downstream of the 35S promoter and a sequence encoding an E-tag immediately upstream of the 35S terminator. The open reading frame of A. thaliana Opr3 was first obtained by RT-PCR using the primers 5′-CACCATGACGGCGGCACAAGGGAACTC-3′ and 5′-TCAGAGGCGGGAAAAAGGAGCC-3′. The resulting PCR product was cloned using pENTR/D to give pENTR/D-AtOPR3. The open reading frames of Dbr2 and Opr3 were introduced separately into pER420 using Gateway® LR Clonase™ recombination reactions (Invitrogen) with pENTR/D-AaDBR2 and pENTR/D-AtOPR3 to give the plasmids pER420-AaDBR2 and pER420-AtOPR3, respectively. Both expression vectors were transferred to the Agrobacterium tumefaciens strain C58C1[pMP90] for transformation of A. thaliana cotyledons using a protocol developed by J.-D. Faure and colleagues. 5J.-D. Faure, personal communication. Transformation was achieved by vacuum infiltration, after which infiltrated cotyledons were left for 4 days in liquid growth medium (Murashige and Skoog medium without sucrose) to allow transient expression of the fusion proteins. GFP localization was examined with a 100M confocal microscope with software package LSM 510 version 3.2 (Zeiss) equipped with a 63× water-corrected objective. Dual GFP fluorescence and chlorophyll autofluorescence was imaged in a multichannel setting with 488- and 543-nm light for GFP and chlorophyll excitation, respectively. Fluorescence emission was captured in the frame-scanning mode alternating GFP fluorescence via a 500–550-nm bandpass filter, and chlorophyll was captured via a 560-nm cut-off filter. Yeast Engineering—The preparation of the plasmids pESC-HIS-FPS-ADS, pESC-LEU-CYP-CPR, and pYESDEST52-AaDBR2 and their use in transformed yeast are described in the supplemental data. Artemisinic Aldehyde Δ11(13) Reductase Activity in A. annua Extracts—The nature of the enzyme involved in the sesquiterpenoid Δ11(13) double bond reduction was initially investigated in extracts of A. annua 2/39 tissues. Preliminary work with flower buds showed reductase activity in the presence of artemisinic aldehyde and NADPH (Fig. 2, D and E). This assay resulted in the detection of a product peak by GC/MS that was identified as (11R)-dihydroartemsinic aldehyde (Fig. 2E) by comparison with natural (Fig. 2A) and semi-synthetic (Fig. 2, B and C) preparations of dihydroartemisinic aldehyde epimers. This peak had a retention time (Fig. 2E) and mass spectrum (supplemental Fig. S4) identical to (11R)-dihydroartemisinic aldehyde synthesized from natural dihydroartemisinic acid (Fig. 2B and supplemental Fig. S4). The retention time was distinct from the (11S)-aldehyde in the mixture formed in the chemical reduction of methyl artemisinate (Fig. 2C). Thus, given the R configuration of artemisinin at C-11, the stereochemistry of the enzyme activity found is consistent with a role in artemisinin biosynthesis. Assay conditions for the reductase reaction were optimized (see “Experimental Procedures” and supplemental data), and extracts from roots, leaves, flower buds, and glandular trichomes were tested. The results for the four tissues are shown in Fig. 3A. Compared with trichome extracts, reductase levels in extracts of flower buds and leaves were at least 10-fold lower. In root extracts, reductase activity was negligible. Given the presence of glandular trichomes on leaf surfaces and at higher densities on floret surfaces, the data from the plant extracts are consistent with a trichome-localized enzyme. Partial Purification and Mass Spectral Analysis of Artemisinic Aldehyde Δ11(13) Reductase from A. annua—With a view toward complete characterization of the reductase, its purification from plant material was attempted. Flower buds were chosen for convenience, in lieu of the more active glandular trichomes. Artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase was partially purified from the flower buds of A. annua line 2/39 using fractional ammonium sulfate precipitation, ion exchange and size exclusion chromatography, and dye affinity batch adsorption (see supplemental data for experimental details). This resulted in an ∼100-fold purification on a protein basis relative to the ammonium sulfate precipitate (supplemental Table S1). The size exclusion chromatography indicated that the native molecular weight of artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase was ∼44,000 (data not shown). The partially purified enzyme was subjected to SDS-PAGE followed by silver staining (supplemental Fig. S1). The most densely staining bands were excised from a polyacrylamide gel, digested with trypsin, and analyzed by LC-MS/MS. When the resulting data from a band corresponding to ∼44 kDa was used to search a data base of A. annua ESTs, the best match was to a cDNA clone “GSTSUB_026_G01” derived from the A. annua trichome-specific cDNA library called GSTSUB (14Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Covello P.S. FEBS Lett. 2006; 580: 1411-1416Crossref PubMed Scopus (334) Google Scholar). The mass spectral data corresponded to the four predicted peptide sequences YFVSNPDLVLR, ELGLQAVAQGDADLVAFGR, ATFYTHDPVVGYTDYPSLDK, and GAYVGTFICCGGYTR. The gene corresponding to this EST was named Dbr2. Analysis of A. annua ESTs (14Teoh K.H. Polichuk D.R. Reed D.W. Nowak G. Covello P.S. FEBS Lett. 2006; 580: 1411-1416Crossref PubMed Scopus (334) Google Scholar) indicated the presence of zero, eight, and nine ESTs corresponding to Dbr2 derived from flower bud (AAFB), glandular trichome (AAGST), and “trichome-minus-bud” (GSTSUB) libraries, respectively. This suggested a relatively high expression of Dbr2 in trichomes relative to flower buds. Isolation of a Full-length Dbr2 cDNA from A. annua 2/39—To allow the characterization of the product of Dbr2, a full-length cDNA clone was obtained by SMART™ rapid amplification of cDNA ends (Clontech). The Dbr2 open reading frame is 1331 bp long and encodes a 415-amino acid protein with a predicted molecular mass of 45.6 kDa. A BLASTP search of GenBank™ with the predicted amino acid protein sequence of Dbr2 revealed greatest sequence identity with plant 12-oxophytodienoate reductases (OPRs) and related enzymes. 6The sequence data relevant to this article can be found in the GenBank™ database under the following accession numbers: A. thaliana OPR1 (GenBank™ accession number NM_106318), OPR2 (GenBank™ accession number NM_106319) and OPR3 (GenBank™ accession number NM_001084415); A. annua Actin1 (GenBank™ accession number EU531837, submitted by authors), amorpha-4,11-diene synthase (GenBank™ accession number AF138959), A. annua cytochrome P-450 reductase (GenBank™ accession number EF104642), Cyp71av1 (GenBank™ accession number DQ315671), Dbr2 (GenBank™ accession number EU704257; submitted by authors) and Fps (GenBank™ accession number AF136602); H. brasiliensis Opr (GenBank™ accession number AAY27752); S. cerevisiae OYE2 (GenBank™ accession number EDN62417); S. lycopersicum Opr1 (GenBank™ accession number Q9XG54) and Opr3 (GenBank™ accession number Q9FEW9); Z. mays Opr7 (GenBank™ accession number AAY26527) and Opr8 (GenBank™ accession number AAY26528). In particular, Dbr2 showed high amino acid sequence identity to tomato (77%; GenBank™ accession number Q9FEW9) and Arabidopsis (68%; GenBank™ accession number AAG15379) OPR3s, both of which have been shown to reduce the 12-oxophytodienoate isomer involved in jasmonate biosynthesis (23Strassner J. Schaller F. Frick U.B. Howe G.A. Weiler E.W. Amrhein N. Macheroux P. Schaller A. Plant J. 2002; 32: 585-601Crossref PubMed Scopus (212) Google Scholar). Fig. 4 illustrates the results of phylogenetic analysis of Dbr2 and a selection of related sequences based on amino acid sequence alignment (supplemental Fig. S2). Dbr2 lies within a branch that includes the tomato and Arabidopsis OPR3s, as well as an OPR3 homologue from Hevea brasiliensis and the maize OPR7 and OPR8 proteins. Based on these sequence comparisons, there is strong support for inclusion of Dbr2 in the α/β barrel fold family of FMN-containing oxidoreductases (24Malone T.E. Madson S.E. Wrobel R.L. Jeon W.B. Rosenberg N.S. Johnson K.A. Bingman C.A. Smith D.W. Phillips Jr., G.N. Markley J. L Fox B.G. Proteins. 2005; 58: 243-245Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar), which include fungal old yellow enzymes (OYEs) (25Fox B.G. Shanklin J. Ai J. Loehr T.M. Sanders-Loehr J. Biochemistry. 1994; 33: 12776-12786Crossref PubMed Scopus (211) Google Scholar, 26Williams R.E. Bruce N.C. Microbiology. 2002; 148: 1607-1614Crossref PubMed Scopus (225) Google Scholar). This protein family is also known as the enoate reductases. Sequence analysis revealed that Dbr2 contains His, His, and Tyr at positions 180, 183, and 185, respectively (supplemental Fig. S2). The residues are highly conserved in OYEs and OPR-like enzymes and are thought to be involved in catalysis. Conserved amino acids in the substrate binding cavity of OPR3s (27Breithaupt C. Kurzbauer R. Lilie H. Schaller A. Strassner J. Huber R. Macheroux P. Clausen T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006; 103: 14337-14342Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar) were also found in corresponding positions of Dbr2 (His239 and Phe69). However, the amino acids that form a loop near the active site of Arabidopsis OPR3, “AYG” (27Breithaupt C. Kurzbauer R. Lilie H. Schaller A. Strassner J. Huber R. Macheroux P. Clausen T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006; 103: 14337-14342Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar), are occupied by “ADGHG” in Dbr2 (A281-G285; supplemental Fig. S2). The pronounced structural differences in the loops adjacent to the active site are thought to be responsible for the differences in substrate specificity of OPRs and OYE (27Breithaupt C. Kurzbauer R. Lilie H. Schaller A. Strassner J. Huber R. Macheroux P. Clausen T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006; 103: 14337-14342Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar). In addition, the carboxyl terminus (Ser-Arg-Leu) that most likely accounts for the peroxisomal location of tomato and Arabidopsis OPR3s (23Strassner J. Schaller F. Frick U.B. Howe G.A. Weiler E.W. Amrhein N. Macheroux P. Schaller A. Plant J. 2002; 32: 585-601Crossref PubMed Scopus (212) Google Scholar, 28Olsen L.J. Plant Mol. Biol. 1998; 38: 163-189Crossref PubMed Google Scholar) is replaced with Ser-Leu-Leu in the carboxyl terminus of Dbr2. This suggests a different subcellular localization of Dbr2 in A. annua (see below). Recombinant Dbr2 Shows Artemisinic Aldehyde Δ11(13) Reductase Activity—For functional characterization of Dbr2, the recombinant enzyme was purified from Escherichia coli cells harboring the plasmid pDEST17-Dbr2. The sizes of Dbr2 determined from sequence-based prediction, electrophoresis (supplemental Fig. S1), and gel filtration indicate that the enzyme functions as a monomer. The purified Dbr2 protein was assayed with various substrates followed by GC/MS analysis. Similar to plant extracts, purified Dbr2 showed NADPH-dependent formation of (11R)-dihydroartemisinic aldehyde as the major product using artemisinic aldehyde as a substrate (supplemental Fig. S3). Control assays with boiled enzyme preparation (not shown) and in the absence of NADPH did not support the production of dihydroartemisinic aldehyde. Given the similarity of Dbr2 to tomato and Arabidopsis 12-oxophytodienoate reductase 3, Dbr2 was tested for activity with 12-oxophytodienoic acid. No products were found in this assay (data not shown). Dbr2 was also tested with other potential substrates, including arteannuin B, artemisinic acid, artemisinic alcohol, artemisitene, (+)-carvone, coniferyl aldehyde, 2-cyclohexen-1-one, 2E-hexenal, 2E-nonenal, (+)-α-pinene, (+)-pulegone, and sabinone. The results indicate that, in addition to artemisinic aldehyde, Dbr2 has activity on 2-cyclohexen-1-one, (+)-carvone, and low activity on 2E-nonenal (∼12% of the rate for artemisinic aldehyde; supplemental Fig. S3). The GC/MS-derived retention times and mass spectra of the products of artemisinic aldehyde, (+)-carvone, 2-cyclohexen-1-one, and 2E-nonenal matched (11R)-dihydroartemsinic aldehyde, dihydrocarvone, cyclohexanone, and nonanal standards, respectively (supplemental Figs. S3 and S4). Based on comparison with a standard 5:1 mixture of (+)-dihydrocarvone/(+)-isodihydrocarvone and assuming that the configuration at C4 was retained, the major and minor products of (+)-carvone