Recent advances in DNA synthesis technology have enabled the construction of novel genetic pathways and genomic elements, furthering our understanding of system-level phenomena. The ability to synthesize large segments of DNA allows the engineering of pathways and genomes according to arbitrary sets of design principles. Here we describe a synthetic yeast genome project, Sc2.0, and the first partially synthetic eukaryotic chromosomes, Saccharomyces cerevisiae chromosome synIXR, and semi-synVIL. We defined three design principles for a synthetic genome as follows: first, it should result in a (near) wild-type phenotype and fitness; second, it should lack destabilizing elements such as tRNA genes or transposons; and third, it should have genetic flexibility to facilitate future studies. The synthetic genome features several systemic modifications complying with the design principles, including an inducible evolution system, SCRaMbLE (synthetic chromosome rearrangement and modification by loxP-mediated evolution). We show the utility of SCRaMbLE as a novel method of combinatorial mutagenesis, capable of generating complex genotypes and a broad variety of phenotypes. When complete, the fully synthetic genome will allow massive restructuring of the yeast genome, and may open the door to a new type of combinatorial genetics based entirely on variations in gene content and copy number.

Abstract Human ZMPSTE24, an integral membrane zinc metalloprotease, is required for conversion of prelamin A to mature lamin A, a component of the nuclear lamina and failure of this processing causes premature ageing disorders. ZMPSTE24 has also been implicated in both type 2 diabetes mellitus and in viral-host response mechanisms, but to date its only confirmed substrate is the precursor for lamin A. Prelamin A is thought to undergo four C-terminal post-translational modifications in the following order: farnesylation, SIM tripeptide cleavage, carboxymethylation and upstream “SY^LL” cleavage. Here we present evidence that the sequence of events does not follow the accepted dogma. We assessed cleavage of long human prelamin A sequence peptides by purified human ZMPSTE24 combined with FRET and mass spectrometry to detect products. Surprisingly, we found that the “SY^LL” cleavage occurs before and independent of the C-terminal CSIM modifications. We also found that ZMPSTE24 does not perform the predicted C^SIM tripeptide cleavage, but rather it removes an IM dipeptide. ZMPSTE24 can perform a tripeptide cleavage with a canonical CaaX box (C: cysteine; a: aliphatic; X: any residue), but the C-terminus of prelamin A is not a true CaaX sequence. Regardless of the C-terminal modifications of prelamin A, ZMPSTE24 can perform upstream SY^LL cleavage, thus removing the unwanted farnesylated C-terminus. Therefore, it is failure of SY^LL cleavage, not the C-terminal processing that is the likely cause of progeroid disorders.

Abstract The integral membrane zinc metalloprotease ZMPSTE24 is important for human health and longevity. ZMPSTE24 performs a key proteolytic step in maturation of prelamin A, the precursor of the nuclear scaffold protein lamin A. Mutations in the genes encoding either prelamin A or ZMPSTE24 that prevent cleavage cause the premature aging disease Hutchinson Gilford Progeria Syndrome (HGPS) and related progeroid disorders. ZMPSTE24 has a novel structure, with seven transmembrane spans that form a large water-filled membrane chamber whose catalytic site faces the chamber interior. Prelamin A is the only known mammalian substrate for ZMPSTE24, however, the basis of this specificity remains unclear. To define the sequence requirements for ZMPSTE24 cleavage, we mutagenized the eight residues flanking the prelamin A scissile bond (TRSY↓LLGN) to all other 19 amino acids, creating a library of 152 variants. We also replaced these eight residues with sequences derived from putative ZMPSTE24 cleavage sites from amphibian, bird, and fish prelamin A. Cleavage of prelamin A variants was assessed using an in vivo yeast assay that provides a sensitive measure of ZMPSTE24 processing efficiency. We found that residues on the C-terminal side of the cleavage site are most sensitive to changes. Consistent with other zinc metalloproteases, including thermolysin, ZMPSTE24 preferred hydrophobic residues at the P1’ position (Leu647), but in addition, showed a similar, albeit muted, pattern at P2’. Our findings begin to define a consensus sequence for ZMPSTE24 that helps to clarify how this physiologically important protease functions and may ultimately lead to identifying additional substrates.