Recent statistical analyses suggest that sequencing of pooled samples provides a cost effective approach to determine genome-wide population genetic parameters. Here we introduce PoPoolation, a toolbox specifically designed for the population genetic analysis of sequence data from pooled individuals. PoPoolation calculates estimates of θ(Watterson), θ(π), and Tajima's D that account for the bias introduced by pooling and sequencing errors, as well as divergence between species. Results of genome-wide analyses can be graphically displayed in a sliding window plot. PoPoolation is written in Perl and R and it builds on commonly used data formats. Its source code can be downloaded from http://code.google.com/p/popoolation/. Furthermore, we evaluate the influence of mapping algorithms, sequencing errors, and read coverage on the accuracy of population genetic parameter estimates from pooled data.

With the delivery of millions of sequence reads in a single experiment, next-generation sequencing (NGS) is currently revolutionizing surveys of microorganism diversity. In particular, when applied to Eukaryotes, we are still lacking a rigorous comparison of morphological and NGS-based diversity estimates. In this report, we studied the diversity and the seasonal community turnover of alveolates (Ciliophora and Dinophyceae) in an oligotrophic freshwater lake by SSU amplicon sequencing with NGS as well as by classical morphological analysis. We complemented the morphological analysis by single-cell PCR followed by Sanger sequencing to provide an unambiguous link to the NGS data. We show that NGS and morphological analyses generally capture frequency shifts of abundant taxa over our seasonal samples. The observed incongruencies are probably largely due to rDNA copy number variation among taxa and heterogeneity in the efficiency of cell lysis. Overall, NGS-based amplicon sequencing was superior in detecting rare species. We propose that in the absence of other nuclear markers less susceptible to copy number variation, rDNA-based diversity studies need to be adjusted for confounding effects of copy number variation.

Understanding the genetic underpinnings of adaptive change is a fundamental but largely unresolved problem in evolutionary biology. Drosophila melanogaster, an ancestrally tropical insect that has spread to temperate regions and become cosmopolitan, offers a powerful opportunity for identifying the molecular polymorphisms underlying clinal adaptation. Here, we use genome-wide next-generation sequencing of DNA pools ('pool-seq') from three populations collected along the North American east coast to examine patterns of latitudinal differentiation. Comparing the genomes of these populations is particularly interesting since they exhibit clinal variation in a number of important life history traits. We find extensive latitudinal differentiation, with many of the most strongly differentiated genes involved in major functional pathways such as the insulin/TOR, ecdysone, torso, EGFR, TGFβ/BMP, JAK/STAT, immunity and circadian rhythm pathways. We observe particularly strong differentiation on chromosome 3R, especially within the cosmopolitan inversion In(3R)Payne, which contains a large number of clinally varying genes. While much of the differentiation might be driven by clinal differences in the frequency of In(3R)P, we also identify genes that are likely independent of this inversion. Our results provide genome-wide evidence consistent with pervasive spatially variable selection acting on numerous loci and pathways along the well-known North American cline, with many candidates implicated in life history regulation and exhibiting parallel differentiation along the previously investigated Australian cline.

The genetic architecture of adaptive traits is of key importance to predict evolutionary responses. Most adaptive traits are polygenic-i.e., result from selection on a large number of genetic loci-but most molecularly characterized traits have a simple genetic basis. This discrepancy is best explained by the difficulty in detecting small allele frequency changes (AFCs) across many contributing loci. To resolve this, we use laboratory natural selection to detect signatures for selective sweeps and polygenic adaptation. We exposed 10 replicates of a Drosophila simulans population to a new temperature regime and uncovered a polygenic architecture of an adaptive trait with high genetic redundancy among beneficial alleles. We observed convergent responses for several phenotypes-e.g., fitness, metabolic rate, and fat content-and a strong polygenic response (99 selected alleles; mean s = 0.059). However, each of these selected alleles increased in frequency only in a subset of the evolving replicates. We discerned different evolutionary paradigms based on the heterogeneous genomic patterns among replicates. Redundancy and quantitative trait (QT) paradigms fitted the experimental data better than simulations assuming independent selective sweeps. Our results show that natural D. simulans populations harbor a vast reservoir of adaptive variation facilitating rapid evolutionary responses using multiple alternative genetic pathways converging at a new phenotypic optimum. This key property of beneficial alleles requires the modification of testing strategies in natural populations beyond the search for convergence on the molecular level.

Abstract The genomic basis of adaptation to novel environments is a fundamental problem in evolutionary biology that has gained additional importance in the light of the recent global change discussion. Here, we combined laboratory natural selection (experimental evolution) in Drosophila melanogaster with genome‐wide next generation sequencing of DNA pools (Pool‐Seq) to identify alleles that are favourable in a novel laboratory environment and traced their trajectories during the adaptive process. Already after 15 generations, we identified a pronounced genomic response to selection, with almost 5000 single nucleotide polymorphisms (SNP; genome‐wide false discovery rates < 0.005%) deviating from neutral expectation. Importantly, the evolutionary trajectories of the selected alleles were heterogeneous, with the alleles falling into two distinct classes: (i) alleles that continuously rise in frequency; and (ii) alleles that at first increase rapidly but whose frequencies then reach a plateau. Our data thus suggest that the genomic response to selection can involve a large number of selected SNPs that show unexpectedly complex evolutionary trajectories, possibly due to nonadditive effects.

Abstract Understanding the genetic architecture of adaptive phenotypes is a key question in evolutionary biology. One particularly promising approach is Evolve and Resequence (E&R), which combines advantages of experimental evolution such as time series, replicate populations and controlled environmental conditions, with whole genome sequencing. The recent analysis of replicate populations from two different Drosophila simulans founder populations, which were adapting to the same novel hot environment, uncovered very different architectures - either many selection targets with large heterogeneity among replicates or fewer selection targets with a consistent response among replicates. Here, we exposed the founder population from Portugal to a cold temperature regime. Although almost no selection targets were shared between the hot and cold selection regime, the adaptive architecture was similar: we identified a moderate number of loci under strong selection (19 selected alleles, mean selection coefficient = 0.072) and very parallel responses in the cold evolved replicates. This similarity across different environments indicates that the adaptive architecture depends more on the ancestry of the founder population than the specific selection regime. These observations have a pronounced impact on our understanding of adaptation in natural populations.

Abstract Phenotypic plasticity is the ability of a single genotype to produce different phenotypes in response to environmental variation. The importance of phenotypic plasticity in natural populations and its contribution to phenotypic evolution during rapid environmental change is widely debated. Here, we show that thermal plasticity of gene expression in natural populations is a key component of its adaptation: evolution to novel thermal environments increases ancestral plasticity rather than mean genetic expression. We determined the evolution of plasticity in gene expression by conducting laboratory natural selection on a Drosophila simulans population in hot and cold environments. After more than 60 generations in the hot environment, 325 genes evolved a change in plasticity relative to the natural ancestral population. Plasticity increased in 75% of these genes, which were strongly enriched for several well-defined functional categories (e.g. chitin metabolism, glycolysis and oxidative phosphorylation). Furthermore, we show that plasticity in gene expression of populations exposed to different temperatures is rather similar across species. We conclude that most of the ancestral plasticity can evolve further in more extreme environments.

Abstract Transcription-coupled repair (TCR) removes base damage on the transcribed strand of a gene to ensure a quick resumption of transcription. Based on the absence of key enzymes for TCR and empirical evidence, TCR was thought to be missing in Drosophila melanogaster . The recent demonstration of TCR in S2 cells raises the question about the involved genes. Since the mismatch repair (MMR) pathway serves a central role in TCR, at least in Escherichia coli , we studied the mutational signatures in flies with a deletion of the MMR gene spellchecker1 ( spel1) , a MutS homolog. Whole-genome sequencing of mutation accumulation (MA) lines obtained 7,345 new single nucleotide variants (SNVs) and 5,672 short indel mutations, the largest data set from an MA study in D. melanogaster . Based on the observed mutational strand-asymmetries, we conclude that TCR is still active without spel1 . The operation of TCR is further confirmed by a negative association between mutation rate and gene expression. Surprisingly, the TCR signatures are detected for introns, but not for exons. We propose that an additional exon-specific repair pathway is masking the signature of TCR. This study presents the first step towards understanding the molecular basis of TCR in Drosophila melanogaster .

Abstract The genetic architecture of adaptive traits is of key importance to predict evolutionary responses. Most adaptive traits are polygenic – i.e. result from selection on a large number of genetic loci – but most molecularly characterized traits have a simple genetic basis. This discrepancy is best explained by the difficulty in detecting small allele frequency changes across many contributing loci. To resolve this, we use laboratory natural selection, a framework that is powerful enough to detect signatures for selective sweeps and polygenic adaptation. We exposed 10 replicates of a Drosophila simulans population to a new temperature regime and uncovered a polygenic architecture of an adaptive trait with high genetic redundancy among adaptive alleles. We observed convergent phenotypic responses, e.g. fitness, metabolic rate and fat content, and a strong polygenic response (99 selected alleles; mean s =0.061). However, each of these selected alleles increased in frequency only in a subset of the evolving replicates. Our results show that natural D. simulans populations harbor a vast reservoir of adaptive variation facilitating rapid evolutionary responses. The observed genetic redundancy potentiates this genotypic variation through multiple genetic pathways leading to phenotypic convergence. This key property of adaptive alleles requires the modification of testing strategies in natural populations beyond the search for convergence on the molecular level.

ABSTRACT Experimental evolution combined with whole-genome sequencing is a powerful approach to study the adaptive architecture of selected traits, in particular when replicated experimental populations evolving in opposite selective conditions (e.g. hot vs. cold temperature) are compared. Nevertheless, such comparisons could be affected by environmental effects shared between selective regimes (e.g. laboratory adaptation), which complicate the interpretation of selection signatures. Here, we used an experimental design, which takes advantage of the simplicity of selection signatures from founder populations with reduced variation, to study the fitness consequences of the laboratory environment (culture conditions) at two temperature regimes. After 20 generations of adaptation at 18°C and 29°C, strong genome-wide selection signatures were observed. About one third of the selection signatures can be either attributed to temperature effects, laboratory adaptation or the joint effects of both. The fitness consequences reflecting the combined effects of temperature and laboratory adaptation were more extreme in the hot environment for 83% of the affected genomic regions, fitting the pattern of larger expression differences between founders at 29°C. We propose that evolve and resequence (E&R) with reduced genetic variation allows to study genome-wide fitness consequences driven by the interaction of multiple environmental factors.