Gibberellins (GAs) are plant hormones that promote a wide range of developmental processes. While GA signalling is well understood, little is known about how GA is transported or how GA distribution is regulated. Here we utilize fluorescently labelled GAs (GA-Fl) to screen for Arabidopsis mutants deficient in GA transport. We show that the NPF3 transporter efficiently transports GA across cell membranes in vitro and GA-Fl in vivo. NPF3 is expressed in root endodermis and repressed by GA. NPF3 is targeted to the plasma membrane and subject to rapid BFA-dependent recycling. We show that abscisic acid (ABA), an antagonist of GA, is also transported by NPF3 in vitro. ABA promotes NPF3 expression and GA-Fl uptake in plants. On the basis of these results, we propose that GA distribution and activity in Arabidopsis is partly regulated by NPF3 acting as an influx carrier and that GA-ABA interaction may occur at the level of transport.

Abstract Faba bean is a widely adapted and high-yielding legume cultivated for its protein-rich seeds 1 . However, the seeds accumulate the anti-nutritional pyrimidine glucosides vicine and convicine, which can cause haemolytic anaemia—favism—in the 400 million individuals genetically predisposed by a deficiency in glucose-6-phosphate dehydrogenase 2 . Here, we identify the first enzyme associated with vicine and convicine biosynthesis, which we name VC1. We show that VC1 co-locates with the major QTL for vicine and convicine content and that the expression of VC1 correlates highly with vicine content across tissues. We also show that low-vicine varieties express a version of VC1 carrying a small, frame-shift insertion, and that overexpression of wild-type VC1 leads to an increase in vicine levels. VC1 encodes a functional GTP cyclohydrolase II, an enzyme normally involved in riboflavin biosynthesis from the purine GTP. Through feeding studies, we demonstrate that GTP is a precursor of vicine both in faba bean and in the distantly related plant bitter gourd. Our results reveal an unexpected biosynthetic origin for vicine and convicine and pave the way for the development of faba bean cultivars that are free from these anti-nutrients, providing a safe and sustainable source of dietary protein.

Abstract Bioengineering aimed at producing complex and valuable plant specialized metabolites in microbial hosts requires efficient uptake of precursor molecules and export of final products to alleviate toxicity and feedback inhibition. Plant genomes encode a vast repository of transporters of specialized metabolites that— due to lack of molecular knowledge—remains largely unexplored in bioengineering. Using phlorizin as a case study—an anti-diabetic and anti-cancerous flavonoid from apple—we demonstrate that brute-force functional screening of plant transporter libraries in Xenopus oocytes is a viable approach to identify transporters for bioengineering. By screening 600 Arabidopsis transporters, we identified and characterized pu rine p ermease 8 (AtPUP8) as a bidirectional phlorizin transporter. Functional expression in the plasma membrane of a phlorizin-producing yeast strain increased phlorizin titer by more than 80 %. This study provides a generic approach for identifying plant exporters of specialized metabolites and demonstrates the potential of transport-engineering for improving yield in bioengineering approaches.

Abstract Many herbivorous insects selectively accumulate plant toxins for defense against predators; however, little is known about the transport processes that enable insects to absorb and store defense compounds in the body. Here, we investigate how a specialist herbivore, the horseradish flea beetle, accumulates high amounts of glucosinolate defense compounds in the hemolymph. Using phylogenetic analyses of coleopteran membrane transporters of the major facilitator superfamily, we identified a clade of glucosinolate-specific transporters ( Pa GTRs) belonging to the sugar porter family. PaGTR expression was predominantly detected in the excretory system, the Malpighian tubules. Silencing of PaGTR s led to elevated glucosinolate excretion, significantly reducing the levels of sequestered glucosinolates in beetles. This suggests that Pa GTRs reabsorb glucosinolates from the Malpighian tubule lumen to prevent their loss by excretion. Ramsay assays performed with dissected Malpighian tubules confirmed a selective retention of glucosinolates. Thus, the selective accumulation of plant defense compounds in herbivorous insects can depend on the ability to prevent excretion.

Abstract Glucosinolates are amino acid-derived defense compounds characteristic of the Brassicales order. Benzylglucosinolate (BGLS) derived from phenylalanine is associated with health-promoting effects, which has primed a desire to produce BGLS in microorganisms for a stable and rich source. In this study, we engineered the BGLS production in Saccharomyces cerevisiae by either stably integrating the biosynthetic genes into the genome or introducing them from plasmids. A comparison of the two approaches exhibited a significantly higher level of BGLS production (9.3-fold) by expression of the genes from genome than from plasmids. Towards optimization of BGLS production from genes stably integrated into the genome, we enhanced expression of the entry point enzymes CYP79A2 and CYP83B1 resulting in a 2-fold increase in BGLS production, but also a 4.8-fold increase in the biosynthesis of the last intermediate desulfo-benzylglucosinolate (dsBGLS). To alleviate the metabolic bottleneck in the last step converting dsBGLS to BGLS by 3’-phosphoadenosine-5’-phosphosulfate (PAPS)-dependent sulfotransferase, SOT16, we first obtained an increased BGLS production by 1.7-fold when overexpressing SOT16 . Next, we introduced APS kinase APK1 of Arabidopsis thaliana for efficient PAPS regeneration, which improved the level of BGLS production by 1.7-fold. Our work shows an optimized production of BGLS in S. cerevisiae and the effect of different approaches for engineering the biosynthetic pathway (plasmid expression and genome integration) on the production level of BGLS.

Abstract Cytochrome P450s catalyse diverse and unique chemical reactions, which makes them invaluable enzymes in nature and industry. Metabolic engineers leverage these unique catalytic properties when refactoring plant biosynthetic pathways into microbial cell factories. However, due to their hydrophobic anchor, microbial expression of membrane-bound cytochrome P450s is challenging. An arsenal of protein engineering strategies was developed to improve their expression in Escherichia coli , but extensive screening is often necessary to tailor the engineering approach to an individual enzyme. Here, we propose a universal strategy that allows the expression of highly active cytochrome P450s in E. coli by systematically evaluating six common N-terminal modifications and their effect on in vivo activity of enzymes from the CYP79 and CYP83 families. We identified transmembrane domain truncation as the only strategy that had a significantly positive effect on all seven tested enzymes, increasing product titres between 2- to 170-fold. When comparing the changes in protein titre and product generation, we show that higher expression does not always translate to higher in vivo activity, thus making protein titre an unreliable screening target. Our results demonstrate that transmembrane domain truncation improves in vivo activity across a broad range of cytochrome P450s with diverse N-terminal sequences and could be applied as the modification-of-choice to avoid the time-consuming screening process and accelerate the future design of E. coli cell factories.

Powdery mildew is a fungal disease that affects a wide range of plants and reduces crop yield worldwide. As obligate biotrophs, powdery mildew fungi manipulate living host cells to suppress defence responses and to obtain nutrients. Members of the plant order Brassicales produce indole glucosinolates that effectively protect them from attack by non-adapted fungi. Indol-3-ylmethyl glucosinolates are constitutively produced in the phloem and transported to epidermal cells for storage. Upon attack, indol-3-ylmethyl glucosinolates are activated by CYP81F2 to provide broad-spectrum defence against fungi. How de novo biosynthesis and transport contribute to defence of powdery mildew-attacked epidermal cells is unknown. Bioassays and glucosinolate analysis indicate that GTR glucosinolate transporters are not involved in antifungal defence. Using quantitative live-cell imaging of fluorophore-tagged markers, we show that accumulation of the glucosinolate biosynthetic enzymes CYP83B1 and SUR1 is induced in epidermal cells attacked by the non-adapted barley powdery mildew Blumeria graminis f.sp. hordei. By contrast, glucosinolate biosynthesis is attenuated during interaction with the virulent powdery mildew Golovinomyces orontii. Interestingly, SUR1 induction is delayed during the Golovinomyces orontii interaction. We conclude that epidermal de novo synthesis of indol-3-ylmethyl glucosinolate contributes to CYP81F2-mediated broad-spectrum antifungal resistance and that adapted powdery mildews may target this process.

Abstract Plants depend on transport processes for correct allocation of specialized metabolites. This is important for optimal defense, avoidance of autotoxicity, connecting compartmented biosynthetic modules and more. Transport of a wide variety of specialized metabolites is mediated by transporters from the Nitrate and Peptide transporter Family (NPF), which belongs to the Major Facilitator Superfamily (MFS). However, the mechanism by which NPF members recognize and transport specialized metabolites remains unknown. Here we mutate eight residues to reciprocally swap the substrate-preference of two closely related glucosinolate transporters (GTRs). Seven of these residues assemble in a ring-like structure in all conformations of the transporters. We labeled the ring-like structure a selectivity filter and based on docking studies, we propose that the interaction between the selectivity filter and the glucosinolate side chain determines whether a given glucosinolate is recognized as a substrate. Besides partly explaining the distinct substrate preference of GTR1 (NPF2.10) and GTR3 (NPF2.9), this study proposes fundamental principles of substrate recognition in the NPF and establishes the GTR subclade as a novel model system for studying structure function relationships in the NPF.

Summary Numerous plants protect themselves from attackers using specialized metabolites. The biosynthesis of these deterrent, often toxic metabolites is costly, as their synthesis diverts energy and resources on account of growth and development. How plants diversify investments into growth and defense is explained by the optimal defense theory. The central prediction of the optimal defense theory is that plants maximize growth and defense by concentrating specialized metabolites in tissues that are decisive for fitness. To date, supporting physiological evidence merely relies on the correlation between plant metabolite distribution and animal feeding preference. Here, we use glucosinolates as a model to examine the effect of changes in chemical defense distribution on actual feeding behavior. Taking advantage of the uniform glucosinolate distribution in transporter mutants, we show that high glucosinolate accumulation in tissues important to fitness protects them by guiding larvae of a generalist herbivore to feed on other tissues. Moreover, we show that mature leaves of Arabidopsis thaliana supply young leaves with glucosinolates to optimize defense against herbivores. Our study provides physiological evidence for the central hypothesis of the optimal defense theory and sheds light on the importance of integrating glucosinolate biosynthesis and transport for optimizing plant defense.

Based on recent in vitro data, a relatively large number of the plant Nitrate transporter 1/Peptide transporter Family (NPF) proteins has been suggested to function as gibberellic acid (GA) transporters. Most GA transporting NPF proteins also appear to transport other structurally unrelated phytohormones or metabolites. Several of the GAs used in previous in vitro assays are membrane permeable weak organic acids whose movement across membranes are influenced by the pH-sensitive ion-trap mechanism. Moreover, a large proportion of in vitro GA transport activities have been demonstrated indirectly via long-term yeast-based GA-dependent growth assays that are limited to detecting transport of bioactive GAs. Thus, there is a need for an optimized transport assay for identifying and characterizing GA transport. Here, we develop an improved transport assay in Xenopus laevis oocytes wherein we directly measure movement of six different GAs across oocyte membranes over short time. We show that membrane permeability of GAs in oocytes can be predicted based on number of oxygen atoms and that several GAs do not diffuse over membranes regardless of changes in pH values. In addition, we show that small changes in internal cellular pH can result in strongly altered distribution of membrane permeable phytohormones. This prompts caution when interpreting heterologous transport activities. We use our transport assay to screen all Arabidopsis thaliana NPF proteins for transport activity towards six GAs (two membrane permeable and four non-permeable). The results presented here, significantly reduce the number of bona fide NPF GA transporters in Arabidopsis and narrow the activity to fewer subclades within the family. Furthermore, to gain first insight into the molecular determinants of substrate specificities towards organic molecules transported in the NPF, we charted all surface exposed amino acid residues in the substrate-binding cavity and correlated them to GA transport. This analysis identified distinct residues within the substrate-binding cavity that are shared between GA transporting NPF proteins; the potential roles of these residues in determining substrate specificity are discussed.