Abstract While speciation underlies novel biodiversity, it is poorly understood how natural selection shapes genomes during speciation. Selection is assumed to act against gene flow at barrier loci, promoting reproductive isolation and speciation. However, evidence for gene flow and selection is often indirect. Here we utilize haplodiploidy to identify candidate barrier loci in hybrids between two wood ant species and integrate survival analysis to directly measure if natural selection is acting at candidate barrier loci. We find multiple candidate barrier loci but surprisingly, proportion of them show leakage between samples collected ten years apart, natural selection favoring leakage in the latest sample. Barrier leakage and natural selection for introgressed alleles could be due to environment-dependent selection, emphasizing the need to consider temporal variation in natural selection in future speciation work. Integrating data on survival allows us to move beyond genome scans, demonstrating natural selection acting on hybrid genomes in real-time.

ABSTRACT Formica red wood ants are a keystone species of boreal forest ecosystems and an emerging model system in the study of speciation and hybridization. Here we performed a standard DNA extraction from a single, field-collected Formica aquilonia × Formica polyctena haploid male and assembled its genome using ∼60× of PacBio long reads. After polishing and contaminant removal, the final assembly was 272 Mb (4,687 contigs, N50 = 1.16 Mb). Our reference genome contains 98.5% of the core Hymenoptera BUSCOs and was scaffolded using the pseudo-chromosomal assembly of a related species, F. selysi (28 scaffolds, N50 = 8.49 Mb). Around one third of the genome consists of repeats, and 17,426 gene models were annotated using both protein and RNAseq data (97.4% BUSCO completeness). This resource is of comparable quality to the few other single individual insect genomes assembled to date and paves the way to genomic studies of admixture in natural populations and comparative genomic approaches in Formica wood ants.

Abstract The application of demographic history modeling and inference to the study of divergence between species is becoming a cornerstone of speciation genomics. The demographic history is usually reconstructed by analysing a single population from each species, assuming that the divergence history inferred between these populations represents the actual speciation history. However, this assumption is rarely explicitly tested, and it may not be met when species diverge with gene flow. For instance, secondary contact between two species after a range expansion may be confined into a specific geographic region. In this study, we tested to what extent the divergence history inferred from two heterospecific populations would vary depending on their geographic locations, using mound-building red wood ants. The wood ant species Formica polyctena and F. aquilonia have contrasting distributions in Europe and naturally hybridize in Finland. We first performed whole-genome resequencing of 20 individuals sampled in multiple populations across both species ranges. We then reconstructed the divergence histories of distinct heterospecific population pairs using a coalescent-based approach. We found that the analysis of these different population pairs always supported a scenario of divergence with gene flow, suggesting that species divergence started in the Pleistocene (ca. 500 kya) and occurred with continuous asymmetrical gene flow from F. aquilonia to F. polyctena until a recent time, when migration stopped (2-19 kya, depending on the population pair considered). However, we found support for contemporary gene flow in the sympatric population pair from Finland, where hybrids have been described. Overall, our results suggest that divergence histories reconstructed from a few individuals may be reliable and applicable at the species level. Nonetheless, the geographical context of populations chosen to represent their species should be taken into account, as it may affect estimates of migration rates between species when gene flow is heterogeneous across their geographical ranges.

ABSTRACT CRISPR-Cas9 has become one of the most prominent gene editing tools available and it has been utilized in various organisms from bacteria to fungi, plants, and animals. In this study, we developed a CRISPR-Cas9 protocol for the black garden ant Lasius niger , a common and easily available study species for lab and field environments. To create indel mutations using CRISPR-Cas9 in L. niger , we targeted three different locations in a well-studied eye pigmentation gene cinnabar , generating several mutations that disrupt the ommochrome biosynthesis pathway and result in the lack of this pigment and therefore, abnormal eye coloration in adult workers. We also developed a protocol to collect L. niger eggs, inject them with CRISPR-Cas9 construct, and rear the eggs into mature adult workers with assistance of nursing workers. We demonstrated for the first time with L. niger that CRISPR-Cas9 is an excellent tool to create targeted mutations for this species. Our protocol can be referred to when developing similar studies for other species of ants and eusocial insects.

ABSTRACT Hybridization is frequent in the wild but it is unclear whether admixture events lead to predictable outcomes and if so, at what timescale. We show that selection led to correlated sorting of genetic variation in less than 50 generations in three hybrid Formica aquilonia × F. polyctena ant populations. Removal of ancestry from the species with the lowest effective population size happened repeatedly in all populations, consistent with purging of deleterious load. This process was modulated by recombination rate variation and the density of functional sites. Moreover, haplotypes with signatures of positive selection in either species were more likely to fix in hybrids. These mechanisms led to mosaic genomes with comparable ancestry proportions. Our work demonstrates predictable evolution over short timescales after admixture in nature.

Abstract Hybridisation and gene flow can have both deleterious and adaptive consequences for natural populations and species. To better understand the extent and consequences of hybridisation in nature, information on naturally hybridising non-model organisms is required, including characterising the structure and extent of natural hybrid zones. Here we study natural populations of five keystone mound-building wood ant ( Formica rufa group) species across Finland. No genomic studies across the species group exist and the extent of hybridisation and genomic differentiation in sympatry is unknown. Combining genome-wide and morphological data, we show that Formica rufa , F. aquilonia , F. lugubris , and F. pratensis form distinct gene pools in Finland. We demonstrate more extensive hybridisation than previously thought between all five species and reveal a mosaic hybrid zone between F. aquilonia , F. rufa and F. polyctena . We show that hybrids between these climatically differently adapted species occupy warmer habitats than the cold-adapted parent F. aquilonia . This suggests hybrids occupy a different microclimatic niche compared to the locally abundant parent. We propose that wood ant hybridisation may increase with a warming climate, and warm winters, in particular, may provide a competitive advantage for the hybrids over F. aquilonia in the future. In summary, our results demonstrate how extensive hybridisation may help persistence in a changing climate. Additionally, they provide an example on how mosaic hybrid zones can have significant ecological and evolutionary consequences because of their large extent and independent hybrid populations that face both ecological and intrinsic selection pressures.

Abstract Behavioural ecology by definition of its founding ‘Tinbergian framework’ is an integrative field, however, it lags behind in incorporating genomic methods. ‘Finding the gene/s for a behaviour’ is still rarely feasible or cost‐effective in the wild but as we show here, genomic data can be used to address broader questions. Here we use avian brood parasitism, a model system in behavioural ecology as a case study to highlight how behavioural ecologists could use the full potential of state‐of‐the‐art genomic tools. Brood parasite–host interactions are one of the most easily observable and amenable natural laboratories of antagonistic coevolution, and as such have intrigued evolutionary biologists for decades. Using worked examples, we demonstrate how genomic data can be used to study the causes and mechanisms of (co)evolutionary adaptation and answer three key questions for the field: (i) Where and when should brood parasitism evolve?, (ii) When and how should hosts defend?, and (iii) Will coevolution persist with ecological change? In doing so, we discuss how behavioural and molecular ecologists can collaborate to integrate Tinbergen's questions and achieve the coherent science that he promoted to solve the mysteries of nature.

Genetic variability is essential for adaptation and isolated populations lacking variability can face extinction when environments change. A currently underappreciated source of genetic variability is hybridization with a closely related lineage. Hybridization can indeed facilitate adaptation e.g. via exchange of adaptive genetic material between species. Here we investigate the potential role of temperature in shaping the genetic variability in a hybrid population between Formica polyctena and F. aquilonia wood ants using long term population genetic data. We find that the frequencies of both parental-like alleles in the hybrid population co-vary with temperature over the years in males but not in females. Results suggest hybridization can lead to sex-specific outcomes that are dependent on ecological factors and that genetic variability resulting from hybridization could help hybrids cope with varying temperature.

In many diploid species the sex chromosomes play a special role in mediating reproductive isolation. In haplodiploids, where females are diploid and males haploid, the whole genome behaves similarly to the X/Z chromosomes of diploids. Therefore, haplodiploid systems can serve as a model for the role of sex chromosomes in speciation and hybridization. A previously described population of Finnish Formica wood ants displays genome-wide signs of ploidally and sexually antagonistic selection resulting from hybridization. Here, hybrid females have increased survivorship but hybrid males are inviable. To understand how the unusual hybrid population may be maintained, we developed a mathematical model with hybrid incompatibility, female heterozygote advantage, recombination, and assortative mating. The rugged fitness landscape resulting from the co-occurrence of heterozygote advantage and hybrid incompatibility results in a sexual conflict in haplodiploids, which is caused by the ploidy difference. Thus, whereas heterozygote advantage always promotes long-term polymorphism in diploids, we find various outcomes in haplodiploids in which the population stabilizes either in favor of males, females, or via maximizing the number of introgressed individuals. We discuss these outcomes with respect to the potential long-term fate of the Finnish wood ant population, and provide approximations for the extension of the model to multiple incompatibilities. Moreover, we highlight the general implications of our results for speciation and hybridization in haplodiploids versus diploids, and how the described fitness relationships could contribute to the outstanding role of sex chromosomes as hotspots of sexual antagonism and genes involved in speciation.