Chronic infection and concomitant airway inflammation is the leading cause of morbidity and mortality for people living with cystic fibrosis (CF). Although chronic infection in CF is undeniably polymicrobial, involving a lung microbiota, infection surveillance and control approaches remain underpinned by classical aerobic culture-based microbiology. How to use microbiomics to direct clinical management of CF airway infections remains a crucial challenge. A pivotal step towards leveraging microbiome approaches in CF clinical care is to understand the ecology of the CF lung microbiome and identify ecological patterns of CF microbiota across a wide spectrum of lung disease. Assessing sputum samples from 299 patients attending 13 CF centres in Europe and the USA, we determined whether the emerging relationship of decreasing microbiota diversity with worsening lung function could be considered a generalised pattern of CF lung microbiota and explored its potential as an informative indicator of lung disease state in CF.We tested and found decreasing microbiota diversity with a reduction in lung function to be a significant ecological pattern. Moreover, the loss of diversity was accompanied by an increase in microbiota dominance. Subsequently, we stratified patients into lung disease categories of increasing disease severity to further investigate relationships between microbiota characteristics and lung function, and the factors contributing to microbiota variance. Core taxa group composition became highly conserved within the severe disease category, while the rarer satellite taxa underpinned the high variability observed in the microbiota diversity. Further, the lung microbiota of individual patient were increasingly dominated by recognised CF pathogens as lung function decreased. Conversely, other bacteria, especially obligate anaerobes, increasingly dominated in those with better lung function. Ordination analyses revealed lung function and antibiotics to be main explanators of compositional variance in the microbiota and the core and satellite taxa. Biogeography was found to influence acquisition of the rarer satellite taxa.Our findings demonstrate that microbiota diversity and dominance, as well as the identity of the dominant bacterial species, in combination with measures of lung function, can be used as informative indicators of disease state in CF. Video Abstract.

Abstract Rapid whole genome sequencing of SARS-CoV-2 has presented the ability to detect new emerging variants of concern in near real time. Here we report the genome of a virus isolated in Pennsylvania in March 2021 that was identified as lineage B.1.1.7 (VOC-202012/01) that also harbors the E484K spike mutation, which has been shown to promote “escape” from neutralizing antibodies in vitro . We compare this sequence to the only 5 other B.1.1.7+E484K genomes from Pennsylvania, all of which were isolated in mid March. Beginning in February 2021, only a small number (n=60) of isolates with this profile have been detected in the US, and only a total of 253 have been reported globally (first in the UK in December 2020). Comparative genomics of all currently available high coverage B.1.1.7+E484K genomes (n=235) available on GISAID suggested the existence of 7 distinct groups or clonal complexes (CC; as defined by GNUVID) bearing the E484K mutation raising the possibility of 7 independent acquisitions of the E484K spike mutation in each background. Phylogenetic analysis suggested the presence of at least 3 distinct clades of B.1.1.7+E484K circulating in the US, with the Pennsylvanian isolates belonging to two distinct clades. Increased genomic surveillance will be crucial for detection of emerging variants of concern that can escape natural and vaccine induced immunity.

Abstract As the pandemic SARS-CoV-2 virus has spread globally its genome has diversified to an extent that distinct clones can now be recognized, tracked, and traced. Identifying clonal groups allows for assessment of geographic spread, transmission events, and identification of new or emerging strains that may be more virulent or more transmissible. Here we present a rapid, whole genome, allele-based method (GNUVID) for assigning sequence types to sequenced isolates of SARS-CoV-2 sequences. This sequence typing scheme can be updated with new genomic information extremely rapidly, making our technique continually adaptable as databases grow. We show that our method is consistent with phylogeny and recovers waves of expansion and replacement of sequence types/clonal complexes in different geographical locations. GNUVID is available as a command line application ( https://github.com/ahmedmagds/GNUVID ).

Abstract Disruptions to the intestinal microbiome during weaning lead to long-term negative effects on host immune function. However, the critical host-microbe interactions occurring during weaning required for healthy immune system development remain poorly understood. We find that restricting microbiome maturation during weaning leads to stunted immune system development and increased susceptibility to enteric infection. We developed a gnotobiotic mouse model of the early-life microbiome designated as Pediatric Community (PedsCom). This nine-member consortium of microbes derived from intestinal microbiomes of preweaning mice stably colonized germfree adult mice and was efficiently transmitted to offspring for multiple generations. Unexpectedly, the relative abundance of PedsCom microbes were largely unaffected by the transition from a milk-based to a fiber rich solid food diet. PedsCom mice developed less peripheral regulatory T cells and Immunoglobulin A, hallmarks of microbiota-driven immune system development. Consistent with defects in maturation, adult PedsCom mice retain high susceptibility to salmonella infection characteristic of young mice and humans. Altogether, our work illustrates how the post-weaning transition in intestinal microbiome composition contributes to normal immune maturation and protection from enteric infection. Accurate modelling of the pre-weaning microbiome provides a window into the microbial requirements of healthy immune development and suggests an opportunity to design microbial interventions at weaning to improve immune system development in human infants. One Sentence Summary Arresting microbiome development stunts immune ontogeny

Abstract Taxonomic classification and phylogenetic analysis of the Neisseriaceae family has focused on the pathogens Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae . Less is known about the relationships of commensal Neisseria species and other Neisseriaceae genera, raising the possibility that the phylogeny of this family may not agree with taxonomy. In this study we used available nucleotide sequences and a phylogenetic approach to assess the Kingella genus and its relatives. We found that this genus is both paraphyletic and polyphyletic. Kingella potus is more closely related to Neisseria bacilliformis than other Kingella species. The Alysiella and Simonsiella genera form a distinct clade within the Kingella genus that is closely related to the pathogens K. kingae and K. negevensis . We find a phylogenetic relationship between C onchiformibius, A lysiella, S imonsiella , and K ingella , which we name the CASK clade. Finally, we define the gene sets that differentiate each genus of the CASK clade from one another and from the rest of the Neisseriaceae family. Importance Understanding the evolutionary relationships between the species in the Neisseriaceae has been a persistent challenge in bacterial systematics due to high recombination rates in these species. Previous studies of this family have focused on N. meningitidis and N. gonorrhoeae . However, previously understudied Neisseriaceae species are gaining new attention, with K. kingae now recognized as a common human pathogen and with Alysiella and Simonsiella being unique in the bacterial world as multicellular organisms. A better understanding of the genomic evolution of the Neisseriaceae can lead to identification of the specific genes and traits that characterize the remarkable diversity of this family.

Discrete classification of SARS-CoV-2 viral genotypes can identify emerging strains and detect geographic spread, viral diversity, and transmission events.We developed a tool (GNUVID) that integrates whole genome multilocus sequence typing and a supervised machine learning random forest-based classifier. We used GNUVID to assign sequence type (ST) profiles to each of 69,686 SARS-CoV-2 complete, high-quality genomes available from GISAID as of October 20 th 2020. STs were then clustered into clonal complexes (CCs), and then used to train a machine learning classifier. We used this tool to detect potential introduction and exportation events, and to estimate effective viral diversity across locations and over time in 16 US states.GNUVID is a scalable tool for viral genotype classification (available at https://github.com/ahmedmagds/GNUVID ) that can be used to quickly process tens of thousands of genomes. Our genotyping ST/CC analysis uncovered dynamic local changes in ST/CC prevalence and diversity with multiple replacement events in different states. We detected an average of 20.6 putative introductions and 7.5 exportations for each state. Effective viral diversity dropped in all states as shelter-in-place travel-restrictions went into effect and increased as restrictions were lifted. Interestingly, our analysis showed correlation between effective diversity and the date that state-wide mask mandates were imposed.Our classification tool uncovered multiple introduction and exportation events, as well as waves of expansion and replacement of SARS-CoV-2 genotypes in different states. Combined with future genomic sampling the GNUVID system could be used to track circulating viral diversity and identify emerging clones and hotspots.

Abstract Most microbes have the capacity to acquire genetic material from their environment. Recombination of foreign DNA yields genomes that are, at least in part, incongruent with the vertical history of their species. Dominant approaches for detecting these transfers are phylogenetic, requiring a painstaking series of analyses including alignment and phylogenetic tree reconstruction. These traditional pan-genomic methods do not scale. Here we propose an unsupervised, alignment-free and tree-free technique based on the sequential information bottleneck (SIB), an optimization procedure designed to extract some portion of relevant information from one random variable conditioned on another. In our case, this joint probability distribution tabulates occurrence counts of k-mers against their genomes of origin with the expectation that recombination will create a strong signal that unifies certain sets of co-occuring k-mers. We conceptualize the technique as a rate-distortion problem, measuring distortion in the relevance information as k-mers are compressed into clusters based on their co-occurrence in the source genomes. The result is fast, model-free, lossy compression of k-mers into groups that learns tracts of shared genome sequence differentiating recombined elements from the vertically inherited core. We show that the technique yields a new recombination measure based purely on information, divorced from any biases and limitations inherent to alignment and phylogeny. Significance The information bottleneck, a lossy compression technique borrowed from the information theoretic and Natural Langauge Processing literature, is well suited to detecting evolutionary patterns in sets of co-occuring k-mers. Here we show that we can detect simulated and real recombination events while highlighting a core set of k-mers that comprise the vertically inherited portion of any set of genomes. Moreover, the compressibility of any given set of genomes offers a new way to compare the pangenomes of clades across the microbial tree of life. In our application, the bottleneck is informed by genome origin, our relevance variable, but the technique is general. The information bottleneck can be used for any biological contingency matrix where the goal is to learn groups from unstructured data.

Abstract Carboxy ester prodrugs have been widely employed as a means to increase oral absorption and potency of phosphonate antibiotics. Prodrugging can successfully mask problematic chemical features that prevent cellular uptake and can be used to target delivery of compounds to specific tissues. However, many carboxy ester promoieties are rapidly hydrolyzed by serum esterases, curbing their potential therapeutic applications. While carboxy ester-based prodrug targeting is feasible, it has seen limited use in microbes due to a paucity of information about the selectivity of microbial esterases. Here we identify the bacterial esterases, GloB and FrmB, that are required for carboxy ester prodrug activation in Staphylococcus aureus. Additionally, we determine the substrate specificities for FrmB and GloB and demonstrate the structural basis of these preferences. Finally, we establish the carboxy ester substrate specificities of human and mouse sera, which revealed several promoieties likely to be serum esterase-resistant while still being microbially labile. These studies lay the groundwork for structure-guided design of anti-staphyloccal promoieties and expand the range of molecules to target staphyloccal pathogens.

Abstract Early life microbiota drive immune system development and influence risk for immune dysfunction later in life, including the development of type 1 diabetes (T1D). Which specific early-life microbes modulate diabetes risk and the timing of these critical interactions are not well understood. To address this gap in knowledge, we screened for microbes that induce systemic IgG1 responses in young NOD mice. We isolated a strain of Akkermansia muciniphila that potently induces systemic IgG1 antibodies and peripheral regulatory T cells (pTregs). Since this mucus-degrading commensal protects NOD mice from T1D and is associated with lower risk of developing T1D in children, we investigated how A. muciniphila impacts early-life host-commensal interactions using gnotobiotic NOD mice colonized with a defined 9-member bacterial consortium that models the early life microbiome. We find that A. muciniphila potently induces pTregs and enhances antibody responses to other commensal microbes. Remarkably, these effects only occur when A. muciniphila colonizes NOD mice prior to weaning, establishing that the specific window of exposure to A. muciniphila shapes adaptive immune system development in diabetes-susceptible NOD mice. This time dependence provides important evidence that early-life exposure may enhance microbiota-based therapies to prevent T1D. One Sentence Summary Akkermansia muciniphila induces peripheral Tregs and enhances antibody responses to itself and other commensals during an early life window.

Nontuberculous mycobacteria (NTM) are a major cause of pulmonary and systemic disease in at-risk populations. Gaps in knowledge about transmission patterns, evolution, and pathogenicity during infection have prompted a recent surge in genomic NTM research. Increased availability and affordability of whole genome sequencing (WGS) techniques, including the advent of Oxford Nanopore Technologies, provide new opportunities to sequence complete NTM genomes at a fraction of the previous cost. However, extracting large quantities of pure genomic DNA is particularly challenging with NTM due to its slow growth and their recalcitrant cell wall. Here we report a DNA extraction protocol that is optimized for long-read WGS of NTM, yielding large quantities of highly pure DNA. Our refined method was compared to 6 other methods with variations in timing of mechanical and enzymatic digestion, quantity of matrix material, and reagents used in extraction and precipitation. We also demonstrate the ability of our optimized protocol to produce sufficient DNA to yield near-complete NTM genome assemblies using Oxford Nanopore Technology long-read sequencing.