The endocytic itineraries of lipid raft markers, such as glycosyl phosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins and glycosphingolipids, are incompletely understood. Here we show that different GPI-anchored proteins have different intracellular distributions; some (such as the folate receptor) accumulate in transferrin-containing compartments, others (such as CD59 and GPI-linked green fluorescent protein [GFP]) accumulate in the Golgi apparatus. Selective photobleaching shows that the Golgi pool of both GPI-GFP and CD59-GFP constantly and rapidly exchanges with the pool of these proteins found on the plasma membrane (PM). We visualized intermediates carrying GPI-GFP from the Golgi apparatus to the PM and separate structures delivering GPI-GFP to the Golgi apparatus. GPI-GFP does not accumulate within endocytic compartments containing transferrin, although it is detected in intracellular structures which are endosomes by the criteria of accessibility to a fluid phase marker and to cholera and shiga toxin B subunits (CTxB and STxB, which are also found in rafts). GPI-GFP and a proportion of the total CTxB and STxB taken up into cells are endocytosed independently of clathrin-associated machinery and are delivered to the Golgi complex via indistinguishable mechanisms. Hence, they enter the Golgi complex in the same intermediates, get there independently of both clathrin and rab5 function, and are excluded from it at 20°C and under conditions of cholesterol sequestration. The PM–Golgi cycling pathway followed by GPI-GFP could serve to regulate lipid raft distribution and function within cells.

Membrane microdomains (“lipid rafts”) enriched in glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins, glycosphingolipids, and cholesterol have been implicated in events ranging from membrane trafficking to signal transduction. Although there is biochemical evidence for such membrane microdomains, they have not been visualized by light or electron microscopy. To probe for microdomains enriched in GPI- anchored proteins in intact cell membranes, we used a novel form of digital microscopy, imaging fluorescence resonance energy transfer (FRET), which extends the resolution of fluorescence microscopy to the molecular level (<100 Å). We detected significant energy transfer between donor- and acceptor-labeled antibodies against the GPI-anchored protein 5′ nucleotidase (5′ NT) at the apical membrane of MDCK cells. The efficiency of energy transfer correlated strongly with the surface density of the acceptor-labeled antibody. The FRET data conformed to theoretical predictions for two-dimensional FRET between randomly distributed molecules and were inconsistent with a model in which 5′ NT is constitutively clustered. Though we cannot completely exclude the possibility that some 5′ NT is in clusters, the data imply that most 5′ NT molecules are randomly distributed across the apical surface of MDCK cells. These findings constrain current models for lipid rafts and the membrane organization of GPI-anchored proteins.

Lipid rafts are conceptualized as membrane microdomains enriched in cholesterol and glycosphingolipid that serve as platforms for protein segregation and signaling. The properties of these domains in vivo are unclear. Here, we use fluorescence recovery after photobleaching to test if raft association affects a protein's ability to laterally diffuse large distances across the cell surface. The diffusion coefficients (D) of several types of putative raft and nonraft proteins were systematically measured under steady-state conditions and in response to raft perturbations. Raft proteins diffused freely over large distances (> 4 microm), exhibiting Ds that varied 10-fold. This finding indicates that raft proteins do not undergo long-range diffusion as part of discrete, stable raft domains. Perturbations reported to affect lipid rafts in model membrane systems or by biochemical fractionation (cholesterol depletion, decreased temperature, and cholesterol loading) had similar effects on the diffusional mobility of raft and nonraft proteins. Thus, raft association is not the dominant factor in determining long-range protein mobility at the cell surface.

“Lipid rafts” enriched in glycosphingolipids (GSL), GPI-anchored proteins, and cholesterol have been proposed as functional microdomains in cell membranes. However, evidence supporting their existence has been indirect and controversial. In the past year, two studies used fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy to probe for the presence of lipid rafts; rafts here would be defined as membrane domains containing clustered GPI-anchored proteins at the cell surface. The results of these studies, each based on a single protein, gave conflicting views of rafts. To address the source of this discrepancy, we have now used FRET to study three different GPI-anchored proteins and a GSL endogenous to several different cell types. FRET was detected between molecules of the GSL GM1 labeled with cholera toxin B-subunit and between antibody-labeled GPI-anchored proteins, showing these raft markers are in submicrometer proximity in the plasma membrane. However, in most cases FRET correlated with the surface density of the lipid raft marker, a result inconsistent with significant clustering in microdomains. We conclude that in the plasma membrane, lipid rafts either exist only as transiently stabilized structures or, if stable, comprise at most a minor fraction of the cell surface.

The interactive properties of liposomes containing phospholipids with covalently attached poly(ethylene glycol) (PEG-lipids) are of interest because such liposomes are being developed as drug delivery vehicles and also are ideal model systems for measuring the properties of surface-grafted polymers. For bilayers containing PEG-lipids with PEG molecular weights of 350, 750, 2000, and 5000, pressure-distance relations have been measured by X-ray diffraction analysis of liposomes subjected to known applied osmotic pressures. The distance between apposing bilayers decreased monotonically with increasing applied pressure for each concentration of a given PEG-lipid. Although for bilayers containing PEG-350 and PEG-750 the contribution of electrostatic repulsion to interbilayer interactions was significant, for bilayers containing PEG-2000 and PEG-5000 the major repulsive pressure between bilayers was a steric pressure due to the attached PEG. The range and magnitude of this steric pressure increased both with increasing PEG-lipid concentration and PEG size, and the extension length of the PEG from the bilayer surface at maximum PEG-lipid concentration depended strongly on the size of the PEG, being less than 35 A for PEG-750, and about 65 A for PEG-2000 and 115 A for PEG-5000. The measured pressure-distance relations have been modeled in terms of current theories (deGennes, 1987; Milner et al., 1988b) for the steric pressure produced by surface-grafted polymers, as modified by us to take into account the effects of polymer polydispersity and the possibility that, at low grafting densities, polymers from apposing bilayers surfaces can interpenetrate or interdigitate. No one theoretical scheme is sufficient to account for all the experimental results. However, for a given pressure regime, PEG-lipid size, and PEG-lipid surface density, the appropriately modified theoretical treatment gives a reasonable fit to the pressure-distance data.

Abstract Caveolins represent a unique family of membrane-remodeling proteins widely expressed across animals (Metazoa). In vertebrates, caveolins are integral to plasma membrane homeostasis, forming flask-shaped invaginations known as caveolae. Recent studies demonstrate that human caveolin-1 assembles into an amphipathic disc composed of 11 spirally packed protomers. However, the structural basis underlying caveolin function across diverse organisms remains elusive. In this study, we computationally predicted structures for 74 evolutionarily diverse caveolins, including a newly identified choanoflagellate caveolin, identifying seven conserved structural elements and a propensity for amphipathic disc formation. Despite extreme sequence variability, cryo-EM structures of caveolins from the purple sea urchin Strongylocentrotus purpuratus and the choanoflagellate Salpingoeca rosetta exhibit striking structural similarities to human caveolin-1, strengthening the computational predictions. These results suggest that caveolins share an ancient structural framework that predates Metazoa and provide a new structure-based paradigm to explore the molecular basis of caveolin function across evolutionary space. Teaser Structures of evolutionarily distant caveolins reveal an ancient, conserved lipid-protein interface predating metazoans.

Abstract Membrane sculpting proteins shape the morphology of cell membranes and facilitate remodeling in response to physiological and environmental cues. Complexes of the monotopic membrane protein caveolin function as essential curvature-generating components of caveolae, flask-shaped invaginations that sense and respond to plasma membrane tension. However, the structural basis for caveolin’s membrane remodeling activity is currently unknown. Here, we show, using cryo-electron microscopy, that the human caveolin-1 complex is composed of 11 protomers organized into a tightly packed disc with a flat membrane-embedded surface. The structural insights suggest a new mechanism for how membrane sculpting proteins interact with membranes and reveal how key regions of caveolin-1, including its scaffolding, oligomerization, and intramembrane domains, contribute to its function. One-Sentence Summary Cryo-electron microscopy reveals that Caveolin-1 oligomerizes into a tightly packed disc with a flat membrane-binding surface.

Abstract AlphaFold2 (AF2) has revolutionized the field of protein structural prediction. Here, we test its ability to predict the tertiary and quaternary structure of a previously undescribed scaffold with new folds and unusual architecture, the monotopic membrane protein caveolin-1 (CAV1). CAV1 assembles into a disc-shaped oligomer composed of 11 symmetrically arranged protomers, each assuming an identical new fold, and contains the largest parallel β-barrel known to exist in nature. Remarkably, AF2 predicts both the fold of the protomers and interfaces between them. It also assembles between 7 and 15 copies of CAV1 into disc-shaped complexes. However, the predicted multimers are energetically strained, especially the parallel β-barrel. These findings highlight the ability of AF2 to correctly predict new protein folds and oligomeric assemblies at a granular level while missing some elements of higher order complexes, thus positing a new direction for the continued development of deep learning protein structure prediction approaches.

ABSTRACT Caveolin-1 (CAV1) is a membrane sculpting protein that oligomerizes to generate flask-shaped invaginations of the plasma membrane known as caveolae. Mutations in CAV1 have been linked to multiple diseases in humans. Such mutations often interfere with oligomerization and the intracellular trafficking processes required for successful caveolae assembly, but the molecular mechanisms underlying these defects have not been structurally explained. Here, we investigate how a breast cancer-associated mutation in one of the most highly conserved residues in CAV1, P132L, affects CAV1 structure and oligomerization. We show that P132 is positioned at a major site of protomer-protomer interactions within the CAV1 complex, providing a structural explanation for why the mutant protein fails to homo-oligomerize correctly. Using a combination of computational, structural, biochemical, and cell biological approaches, we find that despite its homo-oligomerization defects P132L is capable of forming mixed hetero-oligomeric complexes with wild type CAV1 and that these complexes can be incorporated into caveolae. These findings provide insights into the fundamental mechanisms that control the formation of homo- and hetero-oligomers of caveolins that are essential for caveolae biogenesis, as well as how these processes are disrupted in human disease.

Abstract Highly stable oligomeric complexes of the monotopic membrane protein caveolin serve as fundamental building blocks of caveolae. Current evidence suggests these complexes are disc shaped, but the details of their structural organization and how they assemble are poorly understood. Here, we address these questions using single particle electron microscopy of negatively stained recombinant 8S complexes of human Caveolin-1. We show that 8S complexes are toroidal structures ~15 nm in diameter that consist of an outer ring, an inner ring, and central protruding stalk. Moreover, we map the position of the N- and C-termini and determine their role in complex assembly, and visualize the 8S complexes in heterologous caveolae. Our findings provide critical insights into the structural features of 8S complexes and allow us to propose a new model for how these highly stable membrane-embedded complexes are generated.