Abstract FIT (FER-LIKE IRON DEFICIENCY- INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR) and four bHLH Ib transcription factors (TFs) bHLH38, bHLH39, bHLH100 and bHLH101, are the master regulators of Fe uptake genes, and they interact with each other to activate the Fe uptake systems. However, it remains unclear why FIT and bHLH Ib depend on each other to regulate the Fe deficiency response. By analyzing Fe deficiency phenotypes and Fe uptake genes, we found that the quadruple bhlh4x mutants ( bhlh38 bhlh39 bhlh100 bhlh101 ) mimic the fit mutant. Subcellular localization analyses indicate that bHLH38 and bHLH39 are preferentially expressed in the cytoplasm whereas bHLH100 and bHLH101 in the nucleus. Transcriptome data show that the genes involved in Fe signaling pathway show the same expression trends in bhlh4x and fit . Genetic analyses suggest that FIT and bHLH Ib depend each other to regulate the Fe deficiency response. Further biochemical assays indicate that bHLH Ib TFs possess the DNA binding ability and FIT has the transcription activation ability. This work concludes that FIT and bHLH Ib form a functional transcription complex in which bHLH Ib is responsible for target recognition and FIT for transcription activation, explaining why FIT and bHLH Ib interdependently regulate Fe uptake.

Abstract IRONMAN is a family of small peptides which positively regulate the Fe deficiency response. However, the molecular mechanism by which OsIMA1 and OsIMA2 regulate Fe homeostasis was unclear. Here, we reveal that OsIMA1 and OsIMA2 interact with the potential Fe sensors, OsHRZ1 and OsHRZ2. OsIMA1 and OsIMA2 contain a conserved 17-amino acid C-terminal region which is responsible for the interactions with OsHRZ1 and OsHRZ2. The OsIMA1 overexpressing plants have the increased seed Fe concentration and the reduced fertility, as observed in the hrz1-2 loss-of-function mutant plants. Moreover, the expression trends of Fe deficiency inducible genes in the OsIMA1 overexpressing plants are the same to those in the hrz1-2 . Co-expression assays suggest that OsHRZ1 and OsHRZ2 promote the degradation of OsIMA1 proteins. As the interaction partners of OsHRZ1, the OsPRI proteins also interact with OsHRZ2. The conserved C-terminal region of four OsPRIs contributes to the interactions with OsHRZ1 and OsHRZ2. An artificial IMA (aIMA) derived from the C-terminal of OsPRI1 can be also degraded by OsHRZ1. Moreover, the aIMA overexpressing rice plants accumulate more Fe without reduction of fertility. This work establishes the link between OsIMAs and OsHRZs, and develops a new strategy for Fe fortification in rice.

Iron (Fe) homeostasis is essential for plant growth and development. Although tremendous progress has been made in understanding the maintenance of Fe homeostasis in plants, the underlying molecular mechanisms remain elusive. Recently, bHLH11 was reported to function as a negative regulator. However, the molecular mechanism by which bHLH11 regulates Fe homeostasis is unclear. Here, we generated two bhlh11 loss-of-function mutants which displayed the enhanced sensitivity to excessive Fe. bHLH11 is located in the cytoplasm and nucleus due to lack of a nuclear location signal sequence, and its interaction partners, bHLH IVc transcription factors (TFs) (bHLH34, bHLH104, bHLH105 and bHLH115) facilitate its nuclear accumulation. bHLH11 exerts its negative regulation function by recruiting the corepressors TOPLESS/TOPLESS-RELATED. Moreover, bHLH11 antagonizes the transactivity of bHLH IVc TFs towards bHLH Ib genes (bHLH38, bHLH39, bHLH100 and bHLH101). This work indicates that bHLH11 is a crucial component of Fe homeostasis signaling network, playing a pivotal role in the fine-tuning of Fe homeostasis.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

There are two Fe-uptake strategies for maintaining Fe homeostasis in plants. As a special graminaceous plant, rice applies both strategies. However, it remains unclear how these two strategies are regulated in rice. IRON-RELATED BHLH TRANSCRIPTION FACTOR 2 (OsIRO2) is critical for regulating Fe uptake in rice. In this study, we identified an interacting partner of OsIRO2, Oryza sativa FER-LIKE FE DEFICIENCY-INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR (OsFIT), which encodes a bHLH transcription factor. The OsIRO2 protein is localized in the cytoplasm and nucleus, but OsFIT facilitates the accumulation of OsIRO2 in the nucleus. Loss-of-function mutations to OsFIT result in decreased Fe accumulation, severe Fe-deficiency symptoms, and disrupted expression of Fe-uptake genes. In contrast, OsFIT overexpression promotes Fe accumulation and the expression of Fe-uptake genes. Genetic analyses indicated that OsFIT and OsIRO2 function in the same genetic node. Further analysis suggested that OsFIT and OsIRO2 form a functional transcription activation complex to initiate the expression of Fe-uptake genes. Our findings provide a mechanism understanding of how rice maintains Fe homeostasis.