Abstract Leaf senescence is regulated by diverse developmental and environmental factors. Exogenous jasmonic acid (JA) can induce leaf senescence, whereas auxin suppresses this physiological process. Crosstalk between JA and auxin signaling has been well studied, but not during JA-induced leaf senescence. Here, we found that upon methyl jasmonate treatment, Arabidopsis thaliana wrky57 mutants produced typical leaf senescence symptoms, such as yellowing leaves, low chlorophyll content, and high cell death rates. Further investigation suggested that senescence-associated genes were upregulated in the wrky57 mutants. Chromatin immunoprecipitation experiments revealed that WRKY57 directly binds to the promoters of SENESCENCE4 and SENESCENCE-ASSOCIATED GENE12 and represses their transcription. In vivo and in vitro experiments suggested that WRKY57 interacts with JASMONATE ZIM-DOMAIN4/8 (JAZ4/8) and the AUX/IAA protein IAA29, repressors of the JA and auxin signaling pathways, respectively. Consistent with the opposing functions of JA and auxin in JA-induced leaf senescence, JAZ4/8 and IAA29 also displayed opposite functions in JA-induced leaf senescence and competitively interacted with WRKY57. Our results suggested that the JA-induced leaf senescence process can be antagonized by auxin via WRKY57. Moreover, WRKY57 protein levels were downregulated by JA but upregulated by auxin. Therefore, as a repressor in JA-induced leaf senescence, WRKY57 is a common component of the JA- and auxin-mediated signaling pathways.

SNF 1-RELATED PROTEIN KINASE 2 (SnRK2) is a family of plant-specific protein kinases which is the key regulator of hyper-osmotic stress signaling and abscisic acid (ABA)-dependent development in various plants. Among the rice subclass-I and -II SnRK2s, osmotic stress/ABA-activated protein kinase 2 (SAPK2) may be the primary mediator of ABA signaling. However, SAPK2 has not been comprehensively characterized. In this study, we elucidated the functional properties of SAPK2 using loss-of-function mutants produced with the CRISPR/Cas9 system. The SAPK2 expression level was strongly upregulated by drought, high-salinity, and polyethylene glycol (PEG) treatments. The sapk2 mutants exhibited an ABA-insensitive phenotype during the germination and post-germination stages, suggesting that SAPK2 had a pivotal role related to ABA-mediated seed dormancy. The sapk2 mutants were more sensitive to drought stress and reactive oxygen species (ROS) than the wild-type plants, indicating that SAPK2 was important for responses to drought conditions in rice. An additional investigation revealed that SAPK2 increased drought tolerance in the following two ways: (i) by reducing water loss via the accumulation of compatible solutes, promoting stomatal closure, and upregulating the expression levels of stress-response genes such as OsRab16b, OsRab21, OsbZIP23, OsLEA3, OsOREB1 and slow anion channel (SLAC)-associated genes such as OsSLAC1 and OsSLAC7; (ii) by inducing the expression of antioxidant enzyme genes to promote ROS-scavenging abilities that will ultimately decrease ROS damages. Moreover, we also observed that SAPK2 significantly increased the tolerance of rice plants to salt and PEG stresses. These findings imply that SAPK2 is a potential candidate gene for future crop improvement studies.

Sulfur is a macronutrient that is necessary for plant growth and development. Sulfate, a major source of sulfur, is taken up by plant roots and transported into various tissues for assimilation. During sulfate limitation, expression of miR395 is significantly up-regulated. miR395 targets two families of genes, ATP sulfurylases (encoded by APS genes) and sulfate transporter 2;1 (SULTR2;1, also called AST68), both of which are involved in the sulfate metabolism pathway. Their transcripts are suppressed strongly in miR395-over-expressing transgenic Arabidopsis, which over-accumulates sulfate in the shoot but not in the root. APS1 knockdown mutants accumulate twice as much sulfate as the wild-type. By constructing APS4-RNAi transgenic plants, we found that silencing the APS4 gene also results in over-accumulation of sulfate. Even though miR395-over-expressing transgenic plants over-accumulate sulfate in the shoot, they display sulfur deficiency symptoms. Additionally, the distribution of sulfate from older to younger leaves is impaired in miR395-over-expressing plants, similar to a SULTR2;1 loss-of-function mutant. The aps1-1 sultr2;1 APS4-RNAi triply repressed mutants phenocopied miR395-over-expressing plants. Our research showed that miR395 is involved in the regulation of sulfate accumulation and allocation by targeting APS genes and SULTR2;1, respectively.

microRNAs (miRNAs) are a class of negative regulators that take part in many processes such as growth and development, stress responses, and metabolism in plants. Recently, miRNAs were shown to function in plant nutrient metabolism. Moreover, several miRNAs were identified in the response to nitrogen (N) deficiency. To investigate the functions of other miRNAs in N deficiency, deep sequencing technology was used to detect the expression of small RNAs under N-sufficient and -deficient conditions. The results showed that members from the same miRNA families displayed differential expression in response to N deficiency. Upon N starvation, the expression of miR169, miR171, miR395, miR397, miR398, miR399, miR408, miR827, and miR857 was repressed, whereas those of miR160, miR780, miR826, miR842, and miR846 were induced. miR826, a newly identified N-starvation-induced miRNA, was found to target the AOP2 gene. Among these N-starvation-responsive miRNAs, several were involved in cross-talk among responses to different nutrient (N, P, S, Cu) deficiencies. miR160, miR167, and miR171 could be responsible for the development of Arabidopsis root systems under N-starvation conditions. In addition, twenty novel miRNAs were identified and nine of them were significantly responsive to N-starvation. This study represents comprehensive expression profiling of N-starvation-responsive miRNAs and advances our understanding of the regulation of N homeostasis mediated by miRNAs.

The regulation of iron (Fe) homeostasis is critical for plant survival. Although the systems responsible for the reduction, uptake, and translocation of Fe have been described, the molecular mechanism by which plants sense Fe status and coordinate the expression of Fe deficiency-responsive genes is largely unknown. Here, we report that two basic helix-loop-helix-type transcription factors, bHLH34 and bHLH104, positively regulate Fe homeostasis in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Loss of function of bHLH34 and bHLH104 causes disruption of the Fe deficiency response and the reduction of Fe content, whereas overexpression plants constitutively promote the expression of Fe deficiency-responsive genes and Fe accumulation. Further analysis indicates that bHLH34 and bHLH104 directly activate the transcription of the Ib subgroup bHLH genes, bHLH38/39/100/101. Moreover, overexpression of bHLH101 partially rescues the Fe deficiency phenotypes of bhlh34bhlh104 double mutants. Further investigation suggests that bHLH34, bHLH104, and bHLH105 (IAA-LEUCINE RESISTANT3) function as homodimers or heterodimers to nonredundantly regulate Fe homeostasis. This work reveals that plants have evolved complex molecular mechanisms to regulate Fe deficiency response genes to adapt to Fe deficiency conditions.

Abstract The CRISPR/Cas9-sgRNA system has been developed to mediate genome editing and become a powerful tool for biological research. Employing the CRISPR/Cas9-sgRNA system for genome editing and manipulation has accelerated research and expanded researchers’ ability to generate genetic models. However, the method evaluating the efficiency of sgRNAs is lacking in plants. Based on the nucleotide compositions and secondary structures of sgRNAs which have been experimentally validated in plants, we instituted criteria to design efficient sgRNAs. To facilitate the assembly of multiple sgRNA cassettes, we also developed a new strategy to rapidly construct CRISPR/Cas9-sgRNA system for multiplex editing in plants. In theory, up to ten single guide RNA (sgRNA) cassettes can be simultaneously assembled into the final binary vectors. As a proof of concept, 21 sgRNAs complying with the criteria were designed and the corresponding Cas9/sgRNAs expression vectors were constructed. Sequencing analysis of transgenic rice plants suggested that 82% of the desired target sites were edited with deletion, insertion, substitution, and inversion, displaying high editing efficiency. This work provides a convenient approach to select efficient sgRNAs for target editing.

Abstract FIT (FER-LIKE IRON DEFICIENCY- INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR) and four bHLH Ib transcription factors (TFs) bHLH38, bHLH39, bHLH100 and bHLH101, are the master regulators of Fe uptake genes, and they interact with each other to activate the Fe uptake systems. However, it remains unclear why FIT and bHLH Ib depend on each other to regulate the Fe deficiency response. By analyzing Fe deficiency phenotypes and Fe uptake genes, we found that the quadruple bhlh4x mutants ( bhlh38 bhlh39 bhlh100 bhlh101 ) mimic the fit mutant. Subcellular localization analyses indicate that bHLH38 and bHLH39 are preferentially expressed in the cytoplasm whereas bHLH100 and bHLH101 in the nucleus. Transcriptome data show that the genes involved in Fe signaling pathway show the same expression trends in bhlh4x and fit . Genetic analyses suggest that FIT and bHLH Ib depend each other to regulate the Fe deficiency response. Further biochemical assays indicate that bHLH Ib TFs possess the DNA binding ability and FIT has the transcription activation ability. This work concludes that FIT and bHLH Ib form a functional transcription complex in which bHLH Ib is responsible for target recognition and FIT for transcription activation, explaining why FIT and bHLH Ib interdependently regulate Fe uptake.

Abstract Iron (Fe) is an essential trace element for plants. When suffering from Fe deficiency, plants modulate the expression of Fe deficiency responsive genes. POPEYE (PYE) is a key bHLH transcription factor involved in Fe homeostasis. However, the molecular mechanism of PYE regulating the Fe deficiency response remains elusive. We found that the over-expression of PYE attenuates the expression of Fe deficiency responsive genes. PYE directly represses the transcription of bHLH Ib genes ( bHLH38, bHLH39, bHLH100 , and bHLH101 ) by associating with their promoters. Although PYE contains an E thylene response factor-associated A mphiphilic R epression (EAR) motif, it does not interact with the transcriptional corepressors TOPLESS/TOPLESS-RELATED (TPL/TPRs). Subcellular localization analysis indicated that PYE localizes in both the cytoplasm and nucleus. PYE contains a N uclear E xport S ignal (NES) which is required for the cytoplasmic localization of PYE. The mutation of NES amplifies the repression function of PYE, resulting in downregulation of Fe deficiency responsive genes. Co-expression assays indicated that bHLH IVc members (bHLH104, bHLH105/ILR3, and bHLH115) facilitate the nuclear accumulation of PYE. Conversely, PYE indirectly represses transcription activation ability of bHLH IVc. Additionally, PYE directly negatively regulates its own transcription. This study provides insights into the complicated Fe deficiency response signaling pathway and enhances the understanding of PYE functions. Short summary PYE is a negative regulator of Fe homeostasis; however, it was still unclear how PYE integrates the Fe deficiency response signaling. Our study shows that conditional nuclear localization of PYE is crucial for Fe homeostasis. PYE not only negatively regulates FIT-dependent Fe uptake genes by directly targeting bHLH Ib genes, but also negatively regulates its own expression.

Abstract IRONMAN is a family of small peptides which positively regulate the Fe deficiency response. However, the molecular mechanism by which OsIMA1 and OsIMA2 regulate Fe homeostasis was unclear. Here, we reveal that OsIMA1 and OsIMA2 interact with the potential Fe sensors, OsHRZ1 and OsHRZ2. OsIMA1 and OsIMA2 contain a conserved 17-amino acid C-terminal region which is responsible for the interactions with OsHRZ1 and OsHRZ2. The OsIMA1 overexpressing plants have the increased seed Fe concentration and the reduced fertility, as observed in the hrz1-2 loss-of-function mutant plants. Moreover, the expression trends of Fe deficiency inducible genes in the OsIMA1 overexpressing plants are the same to those in the hrz1-2 . Co-expression assays suggest that OsHRZ1 and OsHRZ2 promote the degradation of OsIMA1 proteins. As the interaction partners of OsHRZ1, the OsPRI proteins also interact with OsHRZ2. The conserved C-terminal region of four OsPRIs contributes to the interactions with OsHRZ1 and OsHRZ2. An artificial IMA (aIMA) derived from the C-terminal of OsPRI1 can be also degraded by OsHRZ1. Moreover, the aIMA overexpressing rice plants accumulate more Fe without reduction of fertility. This work establishes the link between OsIMAs and OsHRZs, and develops a new strategy for Fe fortification in rice.