SUMMARY The COVID-19 pandemic, caused by SARS-CoV-2 coronavirus, is a global health issue with unprecedented challenges for public health. SARS-CoV-2 primarily infects cells of the respiratory tract, via Spike glycoprotein binding angiotensin-converting enzyme (ACE2). Circadian rhythms coordinate an organism’s response to its environment and can regulate host susceptibility to virus infection. We demonstrate a circadian regulation of ACE2 in lung epithelial cells and show that silencing BMAL1 or treatment with a synthetic REV-ERB agonist SR9009 reduces ACE2 expression and inhibits SARS-CoV-2 entry. Treating infected cells with SR9009 limits viral replication and secretion of infectious particles, showing that post-entry steps in the viral life cycle are influenced by the circadian system. Transcriptome analysis revealed that Bmal1 silencing induced a wide spectrum of interferon stimulated genes in Calu-3 lung epithelial cells, providing a mechanism for the circadian pathway to dampen SARS-CoV-2 infection. Our study suggests new approaches to understand and improve therapeutic targeting of SARS-CoV-2.

ABSTRACT Understanding the host pathways that define susceptibility to SARS-CoV-2 infection and disease are essential for the design of new therapies. Oxygen levels in the microenvironment define the transcriptional landscape, however the influence of hypoxia on virus replication and disease in animal models is not well understood. In this study, we identify a role for the hypoxic inducible factor (HIF) signalling axis to inhibit SARS-CoV-2 infection, epithelial damage and respiratory symptoms in Syrian hamsters. Pharmacological activation of HIF with the prolyl-hydroxylase inhibitor FG-4592 significantly reduced the levels of infectious virus in the upper and lower respiratory tract. Nasal and lung epithelia showed a reduction in SARS-CoV-2 RNA and nucleocapsid expression in treated animals. Transcriptomic and pathological analysis showed reduced epithelial damage and increased expression of ciliated cells. Our study provides new insights on the intrinsic antiviral properties of the HIF signalling pathway in SARS-CoV-2 replication that may be applicable to other respiratory pathogens and identifies new therapeutic opportunities.

Summary Despite an unprecedented global research effort on SARS-CoV-2, early replication events remain poorly understood. Given the clinical importance of emergent viral variants with increased transmission, there is an urgent need to understand the early stages of viral replication and transcription. We used single molecule fluorescence in situ hybridisation (smFISH) to quantify positive sense RNA genomes with 95% detection efficiency, while simultaneously visualising negative sense genomes, sub-genomic RNAs and viral proteins. Our absolute quantification of viral RNAs and replication factories revealed that SARS-CoV-2 genomic RNA is long-lived after entry, suggesting that it avoids degradation by cellular nucleases. Moreover, we observed that SARS-CoV-2 replication is highly variable between cells, with only a small cell population displaying high burden of viral RNA. Unexpectedly, the B.1.1.7 variant, first identified in the UK, exhibits significantly slower replication kinetics than the Victoria strain, suggesting a novel mechanism contributing to its higher transmissibility with important clinical implications. Graphical Abstract In brief By detecting nearly all individual SARS-CoV-2 RNA molecules, we quantified viral replication and defined cell susceptibility to infection. We discovered that a minority of cells show significantly elevated viral RNA levels and observed slower replication kinetics for the Alpha variant relative to the Victoria strain. Highlights Single molecule quantification of SARS-CoV-2 replication uncovers early infection kinetics There is substantial heterogeneity between cells in rates of SARS-CoV-2 replication Genomic RNA is stable and persistent during the initial stages of infection B.1.1.7 variant replicates more slowly than the Victoria strain

ABSTRACT Hepatitis B virus (HBV) infection is of global importance with over 2 billion people exposed to the virus during their lifetime and at risk of progressive liver disease, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HBV is a member of the hepadnaviridae family that replicates via episomal copies of a covalently closed circular DNA (cccDNA) genome. The chromatinization of this small viral genome, with overlapping open reading frames and regulatory elements, suggests an important role for epigenetic pathways to regulate viral transcription. The chromatin-organising transcriptional insulator protein CCCTC-binding factor (CTCF) has been reported to regulate transcription in a diverse range of viruses. We identified two conserved CTCF binding sites in the HBV genome within Enhancer I and chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis demonstrated an enrichment of CTCF binding to integrated or episomal copies of the viral genome. siRNA knockdown of CTCF results in a significant increase in pre-genomic RNA levels in de novo infected HepG2 cells and those supporting episomal HBV DNA replication. Furthermore, mutation of these sites in HBV DNA minicircles abrogated CTCF binding and increased pre-genomic RNA levels, providing evidence of a direct role for CTCF in repressing HBV transcription. IMPORTANCE Hepatitis B virus (HBV) is a global cause of liver disease. At least 300 million individuals are chronically infected with HBV, frequently leading to life-threatening liver cirrhosis and cancer. Following viral entry, HBV DNA enters the nucleus and is bound by histones that are subject to epigenetic modification. The HBV genome contains two enhancer elements that stimulate viral transcription but the interplay between the viral enhancers and promoters is not fully understood. We have identified the host cell protein CCCTC binding factor (CTCF) as a repressor of HBV gene expression. CTCF binds to the HBV genome within Enhancer I and represses transcription of pre-genomic RNA. These findings provide new insights into how HBV transcription is regulated and show a new role for CTCF as a transcriptional insulator by associating with the viral genome between Enhancer I and the downstream basal core promoter.

ABSTRACT Human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) is a life-threatening pathogen that still lacks curative therapies or vaccines. Circadian rhythms are endogenous daily oscillations that coordinate an organism’s response to its environment and invading pathogens. Recent reports of diurnal variation in peripheral viral load in HIV-1 infected subjects highlights the need for mechanistic studies. Here, we demonstrate rhythmic HIV-1 replication in circadian-synchronised model systems and show the circadian transcription factors, BMAL1 and REV-ERB, bind conserved motifs in the HIV-1 promoter. REV-ERB competes with ROR for binding to the same regulatory motif, and we uncover a role for ROR inhibitors to perturb rhythmic HIV-1 replication and host gene expression. We demonstrate that many HIV-1 host factors are circadian regulated and likely to define rhythmic viral replication. In summary, this study increases our understanding of the mechanisms underlying the circadian regulation of HIV that can inform HIV therapy and management.

Human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) is a life-threatening pathogen that still lacks a curative therapy or vaccine. Despite the reduction in AIDS-related deaths achieved by current antiretroviral therapies, drawbacks including drug resistance and the failure to eradicate infection highlight the need to identify new pathways to target the infection. Circadian rhythms are endogenous 24-hour oscillations which regulate physiological processes including immune responses to infection, and there is an emerging role for the circadian components participating viral replication. The molecular clock consists of transcriptional/translational feedback loops that generate rhythms. In mammals, CLOCK and BMAL1 activate rhythmic transcription of genes including the nuclear receptor REV-ERBα, which represses BMAL1 and plays an essential role in sustaining a functional clock. We investigated whether REV-ERB activity regulates HIV-1 replication, and found REV-ERB agonists inhibited HIV-1 promoter activity in cell lines, primary human CD4 T cells and macrophages, whilst antagonism or genetic disruption of REV-ERB increased promoter activity. Furthermore, the REV-ERB agonist SR9009 inhibited promoter activity of different HIV-subtypes and HIV-1 replication in primary T cells. This study shows a role for REV-ERB synthetic ligands to inhibit HIV-1 LTR promoter activity and viral replication, supporting a role for circadian clock transcription factors in regulating HIV-1 replication.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Hepatitis B virus (HBV) is an enveloped DNA virus that contains a partially double-stranded relaxed circular (rc) DNA. Upon infection, rcDNA is delivered to the nucleus where it is repaired to covalently closed circular (ccc) DNA that serves as the transcription template for all viral RNAs. Our understanding of HBV particle entry dynamics and host pathways regulating intracellular virus trafficking and cccDNA formation is limited. The discovery of sodium taurocholate co-transporting peptide (NTCP) as the primary receptor allows studies on these early steps in viral life cycle. We employed a synchronized infection protocol to quantify HBV entry kinetics. HBV attachment to cells at 4 C is independent of NTCP, however, subsequent particle uptake is NTCP-dependent and reaches saturation at 12h post-infection. HBV uptake is clathrin- and dynamin dependent with actin and tubulin playing a role in the first 6h of infection. Cellular fractionation studies demonstrate HBV DNA in the nucleus within 6h of infection and cccDNA was first detected at 24h post-infection. Our studies show the majority (83%) of cell bound particles enter HepG2-NTCP cells, however, only a minority (<1%) of intracellular rcDNA was converted to cccDNA, highlighting this as a rate-limiting in establishing infection in vitro. This knowledge highlights the deficiencies in our in vitro cell culture systems and will inform the design and evaluation of physiologically relevant models that support efficient HBV replication.

ABSTRACT Respiratory syncytial virus (RSV) is a global healthcare problem, causing respiratory illness in young children and elderly individuals. However, our knowledge of the host pathways that define susceptibility to RSV infection and disease severity is limited. Hypoxia inducible factors (HIFs) define cellular metabolic processes in response to low oxygen and are recognised to play a key role in regulating inflammatory responses in the lower respiratory tract. We demonstrate a role for hypoxia inducible factors (HIFs) to suppress RSV entry and RNA replication. We show that hypoxia and HIF prolyl-hydroxylase inhibitors significantly reduce expression of the RSV entry receptor nucleolin and inhibit viral driven cell-cell fusion. We identify a HIF regulated microRNA, miR-494, that regulates nucleolin expression. In RSV-infected mice, treatment with the clinically approved HIF prolyl-hydroxylase inhibitor, Daprodustat, reduced the level of infectious virus and infiltrating monocytes and neutrophils in the lung. This study highlights a role for HIF-signalling to limit multiple aspects of RSV infection and associated inflammation and informs future therapeutic approaches for treating this respiratory pathogen.