Abstract Aging is characterized by a gradual loss of function occurring at the molecular, cellular, tissue and organismal levels. At the chromatin level, aging associates with progressive accumulation of epigenetic errors that eventually lead to aberrant gene regulation, stem cell exhaustion, senescence, and deregulated cell/tissue homeostasis. Nuclear reprogramming to pluripotency can revert both the age and the identity of any cell to that of an embryonic cell. Recent evidence shows that transient reprogramming can ameliorate age-associated hallmarks and extend lifespan in progeroid mice. However, it is unknown how this form of rejuvenation would apply to naturally aged human cells. Here we show that transient expression of nuclear reprogramming factors, mediated by expression of mRNAs, promotes a rapid and broad amelioration of cellular aging, including resetting of epigenetic clock, reduction of the inflammatory profile in chondrocytes, and restoration of youthful regenerative response to aged, human muscle stem cells, in each case without abolishing cellular identity.

SUMMARY Selectively ablating senescent cells (“senolysis”) is an evolving therapeutic approach for age-related diseases. Current senolytics are limited to local administration by potency and side effects. While genetic screens could identify senolytics, current screens are underpowered for identifying genes that regulate cell death due to limitations in screen methodology. Here, we establish Death-seq, a positive selection CRISPR screen optimized to identify enhancers and mechanisms of cell death. Our screens identified synergistic enhancers of cell death induced by the known senolytic ABT-263, a BH3 mimetic. SMAC mimetics, enhancers in our screens, synergize with ABT-199, another BH3 mimetic that is not senolytic alone, clearing senescent cells in models of age-related disease while sparing human platelets, avoiding the thrombocytopenia associated with ABT-263. Death-seq enables the systematic screening of cell death pathways to uncover molecular mechanisms of regulated cell death subroutines and identify drug targets for diverse pathological states such as senescence, cancer, and neurodegeneration.

Aging is characterized by a gradual loss of function occurring at the molecular, cellular, tissue and organismal levels. At the chromatin level, aging is associated with the progressive accumulation of epigenetic errors that eventually lead to aberrant gene regulation, stem cell exhaustion, senescence, and deregulated cell/tissue homeostasis. The technology of nuclear reprogramming to pluripotency, through over-expression of a small number of transcription factors, can revert both the age and the identity of any cell to that of an embryonic cell by driving epigenetic reprogramming. Recent evidence has shown that transient transgenic reprogramming can ameliorate age-associated hallmarks and extend lifespan in progeroid mice. However, it is unknown how this form of epigenetic rejuvenation would apply to physiologically aged cells and, importantly, how it might translate to human cells. Here we show that transient reprogramming, mediated by transient expression of mRNAs, promotes a rapid reversal of both cellular aging and of epigenetic clock in human fibroblasts and endothelial cells, reduces the inflammatory profile in human chondrocytes, and restores youthful regenerative response to aged, human muscle stem cells, in each case without abolishing cellular identity. Our method, that we named Epigenetic Reprogramming of Aging (ERA), paves the way to a novel, potentially translatable strategy for ex vivo cell rejuvenation treatment. In addition, ERA holds promise for in vivo tissue rejuvenation therapies to reverse the physiological manifestations of aging and the risk for the development of age-related diseases.

Selectively ablating damaged cells is an evolving therapeutic approach for age-related disease. Current methods for genome-wide screens to identify genes whose deletion might promote the death of damaged or senescent cells are generally underpowered because of the short timescales of cell death as well as the difficulty of scaling non-dividing cells. Here, we establish “Death-seq,” a positive-selection CRISPR screen optimized to identify enhancers and mechanisms of cell death. Our screens identified synergistic enhancers of cell death induced by the known senolytic ABT-263. The screen also identified inducers of cell death and senescent cell clearance in models of age-related diseases by a related compound, ABT-199, which alone is not senolytic but exhibits less toxicity than ABT-263. Death-seq enables the systematic screening of cell death pathways to uncover molecular mechanisms of regulated cell death subroutines and identifies drug targets for the treatment of diverse pathological states such as senescence, cancer, and fibrosis.