Abstract Recent advances in gene therapy have brought novel treatment options for cancer. However, the full potential of this approach has yet to be unlocked due to the safety concerns and limited payload capacity of commonly utilized viral vectors. Virus-free DNA transposons, including piggyBac , have potential to obviate these shortcomings. In this study, we improved a previously developed modified piggyBac system with superior transposition efficiency. We demonstrated that the internal domain sequences (IDS) within the 3’ terminal repeat domain of hyperactive piggyBac ( hyPB ) donor vector contain dominant enhancer elements. Plasmid-free donor vector devoid of IDS was used in conjunction with a helper plasmid expressing Quantum PBase ™ v2 to generate an optimal piggyBac system, Quantum pBac ™ ( qPB ), for use in T cells. Cells transfected with qPB expressing CD20/CD19 CAR outperformed those transfected with the same donor vector and plasmid expressing hyPB transposase in terms of CAR-T cell production. Importantly, qPB yielded mainly CD8 + CAR-T SCM cells, and the qPB- induced CAR-T cells effectively eliminated CD20/CD19-expressing tumor cells both in vitro and in vivo . Our findings confirm qPB as a promising virus-free vector system with a payload capacity to incorporate multiple genes. This system is highly efficient and potentially safe for mediating transgene integration.

ABSTRACT Background CD19-targeted chimeric antigen receptor therapies (CAR19) have driven a paradigm shift in the treatment of relapsed/refractory B-cell malignancies. However, >50% of CAR19-treated patients experienced progressive disease mainly due to antigen escape and low persistence. Clinical prognosis is heavily influenced by CAR-T cell function and systemic cytokine toxicities. Furthermore, it remains a challenge to efficiently, cost-effectively, and consistently manufacture clinically relevant number of virally engineered CAR-T cells. Methods Using a highly efficient piggyBac transposon-based vector, Quantum pBac , we developed a virus-free cell engineering system, Quantum CART (qCART ™ ) , for development and production of multiplex CAR-T therapies. Results Here, we demonstrated in vitro and in vivo that consistent, robust, and functional CD20/CD19 dual-targeted CAR-T stem cell memory (T SCM ) cells can be efficiently manufactured using the qCART ™ system for clinical application. qCART ™-manufactured CAR-T cells from cancer patients expanded efficiently, rapidly eradicated tumors, and can be safely controlled via an iCasp9 suicide gene-inducing drug. Conclusions The qCART ™ system is an elegant system for the manufacturing of CAR-T products having all the desired CAR-T therapy attributes. We believe that the simplicity of manufacturing multiplex CAR-T cells using the qCART ™ system will not only significantly enhance the accessibility of CAR-T therapy but also unlock the full potential of armored CAR-T therapy for the treatment of solid tumors in the future. What is already known on this topic Despite the considerable success which has been achieved with CD19-targeted chimeric antigen receptor therapies (CAR19), >50% of CAR19-treated patients still experienced progressive disease. Therefore, there is a need to further improve CAR19 therapies. Current CAR19 therapies commonly utilize virus-based cell engineering methods. CAR-T production using these methods face multiple hurdles, including difficulties to efficiently, cost-effectively, and consistently manufacture clinically relevant number of CAR-T cells. We have previously used a highly efficient piggyBac transposon-based vector, Quantum pBac , to establish Quantum CART ( qCART ™) which is a virus-free cell engineering system for development and production of multiplex CAR-T therapies. What this study adds In this report, we further demonstrate in vitro and in vivo that consistent, robust, and functional iCasp9-regulatable, CD20/CD19 dual-targeted CAR-T stem cell memory (T SCM ) cells can be efficiently manufactured using the qCART ™ system for clinical application. These cells possess all the desired attributes for ensuring therapeutic efficacy in CAR-T therapy, including high CAR-T SCM , balanced CD8/CD4 ratio, low exhaustion and senescence marker expressions, and high ex vivo and in vivo expansion capacity. Importantly, we show that qCART ™-manufactured CAR-T cells from hematological cancer patients expanded efficiently, effectively eradicated tumors, and can be safely controlled via an iCasp9 suicide gene-inducing drug. We believe that the simplicity of manufacturing multiplex CAR-T cells using the qCART ™ system will not only significantly enhance the accessibility of CAR-T therapy but also unlock the full potential of armored CAR-T therapy for the treatment of solid tumors in the future. How this study might affect research, practice or policy Our findings demonstrate that qCART ™ is a virus-free CAR-T engineering system for manufacturing CAR-T SCM cells from either healthy donors or hematological cancer patients, that possess all the desired attributes for a successful CAR-T therapy. These cells expanded efficiently, rapidly eradicated tumors, and can be safely controlled via activation of iCasp9. We expect that this simple yet robust system for manufacturing multiplex CAR-T cells will advance the CAR-T field.

Abstract Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy has the potential to transform cancer treatment. However, CAR-T therapy application is currently limited to certain types of relapsed/refractory B cell lymphomas. To unlock the full potential of CAR-T therapy, technologic breakthroughs will be needed in multiple areas, including optimization of autologous CAR-T development, shortening the innovation cycle, and further manufacturing advancement of next-generation CAR-T therapies. Here, we established a simple and robust virus-free multiplex Quantum CART ™ system that seamlessly and synergistically integrates four platforms: 1. GTailor ™ for rapid identification of lead CAR construct design, 2. Quantum Nufect ™ for effective but gentle electroporation-based gene delivery, 3. Quantum pBac ™ , featuring a virus-free transposon-based vector with large payload capacity and integration profile similar to retrovirus, and 4. iCellar ™ for robust and high-quality CAR + T memory stem cell expansion. This robust, virus-free multiplex Quantum CART ™ system is expected to unleash the full potential of CAR-T therapy for treating diseases.