APUTATIVE chemokine receptor that we previously cloned and termed LESTR1 has recently been shown to function as a co-receptor (termed fusin) for lymphocyte-tropic HIV-1 strains2. Cells expressing CD4 became permissive to infection with T-cell-line-adapted HIV-1 strains of the syncytium-inducing phenotype after transfection with LESTR/fusin complementary DNA. We report here the identification of a human chemokine of the CXC type, stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), as the natural ligand for LESTR/fusin, and we propose the term CXCR-4 for this receptor, in keeping with the new chemokine-receptor nomenclature. SDF-1 activates Chinese hamster ovary (CHO) cells transfected with CXCR-4 cDNA as well as blood leukocytes and lymphocytes. In cell lines expressing CXCR-4 and CD4, and in blood lymphocytes, SDF-1 is a powerful inhibitor of infection by lymphocyte-tropic HIV-1 strains, whereas the CC chemokines RANTES, MIP-lα and MIP-1β, which were shown previously to prevent infection with primary, monocyte-tropic viruses3, are inactive. In combination with CC chemokines, which block the infection with monocyte/macrophage-tropic viruses, SDF-1 could help to decrease virus load and prevent the emergence of the syncytium-inducing viruses which are characteristic of the late stages of AIDS4.

T cells infiltrating inflammatory sites are usually of the activated/memory type. The precise mechanism for the positioning of these cells within tissues is unclear. Adhesion molecules certainly play a role; however, the intricate control of cell migration appears to be mediated by numerous chemokines and their receptors. Particularly important chemokines for activated/memory T cells are the CXCR3 ligands IP-10 and Mig and the CCR5 ligands RANTES, macrophage inflammatory protein-1alpha, and macrophage inflammatory protein-1beta. We raised anti-CXCR3 mAbs and were able to detect high levels of CXCR3 expression on activated T cells. Surprisingly, a proportion of circulating blood T cells, B cells, and natural killer cells also expressed CXCR3. CCR5 showed a similar expression pattern as CXCR3, but was expressed on fewer circulating T cells. Blood T cells expressing CXCR3 (and CCR5) were mostly CD45RO+, and generally expressed high levels of beta1 integrins. This phenotype resembled that of T cells infiltrating inflammatory lesions. Immunostaining of T cells in rheumatoid arthritis synovial fluid confirmed that virtually all such T cells expressed CXCR3 and approximately 80% expressed CCR5, representing high enrichment over levels of CXCR3+ and CCR5+ T cells in blood, 35 and 15%, respectively. Analysis by immunohistochemistry of various inflamed tissues gave comparable findings in that virtually all T cells within the lesions expressed CXCR3, particularly in perivascular regions, whereas far fewer T cells within normal lymph nodes expressed CXCR3 or CCR5. These results demonstrate that the chemokine receptor CXCR3 and CCR5 are markers for T cells associated with certain inflammatory reactions, particularly TH-1 type reactions. Moreover, CXCR3 and CCR5 appear to identify subsets of T cells in blood with a predilection for homing to these sites.

A human receptor that is selective for the CXC chemokines IP10 and Mig was cloned and characterized. The receptor cDNA has an open reading frame of 1104-bp encoding a protein of 368 amino acids with a molecular mass of 40,659 dalton. The sequence includes seven putative transmembrane segments characteristic of G-protein coupled receptors. It shares 40.9 and 40.3% identical amino acids with the two IL-8 receptors, and 34.2-36.9% identity with the five known CC chemokine receptors. The IP10/Mig receptor is highly expressed in IL-2-activated T lymphocytes, but is not detectable in resting T lymphocytes. B lymphocytes, monocytes and granulocytes. It mediates Ca2+ mobilization and chemotaxis in response to IP10 and Mig, but does not recognize the CXC-chemokines IL-8, GRO alpha, NAP-2, GCP-2. ENA78, PF4, the CC-chemokines MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1 alpha, MIP-1 beta. RANTES, 1309, eotaxin, nor lymphotactin. The exclusive expression in activated T-lymphocytes is of high interest since the receptors for chemokines which have been shown so far to attract lymphocytes, e.g., MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-1 alpha, MIP-1 beta, and RANTES, are also found in monocytes and granulocytes. The present observations suggest that the IP10/Mig receptor is involved in the selective recruitment of effector T cells.

Leukocyte traffic through secondary lymphoid tissues is finely tuned by chemokines. We have studied the functional properties of a human T cell subset marked by the expression of CXC chemokine receptor 5 (CXCR5). Memory but not naive T cells from tonsils are CXCR5(+) and migrate in response to the B cell-attracting chemokine 1 (BCA-1), which is selectively expressed by reticular cells and blood vessels within B cell follicles. Tonsillar CXCR5(+) T cells do not respond to other chemokines present in secondary lymphoid tissues, including secondary lymphoid tissue chemokine (SLC), EBV-induced molecule 1 ligand chemokine (ELC), and stromal cell-derived factor 1 (SDF-1). The involvement of tonsillar CXCR5(+) T cells in humoral immune responses is suggested by their localization in the mantle and light zone germinal centers of B cell follicles and by the concomitant expression of activation and costimulatory markers, including CD69, HLA-DR, and inducible costimulator (ICOS). Peripheral blood CXCR5(+) T cells also belong to the CD4(+) memory T cell subset but, in contrast to tonsillar cells, are in a resting state and migrate weakly to chemokines. CXCR5(+) T cells are very inefficient in the production of cytokines but potently induce antibody production during coculture with B cells. These properties portray CXCR5(+) T cells as a distinct memory T cell subset with B cell helper function, designated here as follicular B helper T cells (T(FH)).

Chemokines are essential mediators of normal leukocyte trafficking as well as of leukocyte recruitment during inflammation. We describe here a novel non-ELR CXC chemokine identified through sequence analysis of cDNAs derived from cytokine-activated primary human astrocytes. This novel chemokine, referred to as I-TAC (interferon-inducible T cell alpha chemoattractant), is regulated by interferon (IFN) and has potent chemoattractant activity for interleukin (IL)-2-activated T cells, but not for freshly isolated unstimulated T cells, neutrophils, or monocytes. I-TAC interacts selectively with CXCR3, which is the receptor for two other IFN-inducible chemokines, the IFN-gamma-inducible 10-kD protein (IP-10) and IFN-gamma- induced human monokine (HuMig), but with a significantly higher affinity. In addition, higher potency and efficacy of I-TAC over IP-10 and HuMig is demonstrated by transient mobilization of intracellular calcium as well as chemotactic migration in both activated T cells and transfected cell lines expressing CXCR3. Stimulation of astrocytes with IFN-gamma and IL-1 together results in an approximately 400,000-fold increase in I-TAC mRNA expression, whereas stimulating monocytes with either of the cytokines alone or in combination results in only a 100-fold increase in the level of I-TAC transcript. Moderate expression is also observed in pancreas, lung, thymus, and spleen. The high level of expression in IFN- and IL-1-stimulated astrocytes suggests that I-TAC could be a major chemoattractant for effector T cells involved in the pathophysiology of neuroinflammatory disorders, although I-TAC may also play a role in the migration of activated T cells during IFN-dominated immune responses.

Although most leukocytes, T lymphocytes in particular, respond to several different chemokines, there is virtually no information on chemokine activities and chemokine receptors in B lymphocytes. A putative chemokine receptor, BLR1, that is expressed in Burkitt's lymphoma cells and B lymphocytes was cloned a few years ago. Deletion of the gene for BLR1 yielded mice with abnormal primary follicles and germinal centers of the spleen and Peyer's patches, reflecting the inability of B lymphocytes to migrate into B cell areas. By screening expressed sequence tag DNA sequences, we have identified a CXC chemokine, termed B cell–attracting chemokine 1 (BCA-1), that is chemotactic for human B lymphocytes. BCA-1 cDNA encodes a protein of 109 amino acids with a leader sequence of 22 residues. The mature protein shares 23–34% identical amino acids with known CXC chemokines and is constitutively expressed in secondary lymphoid organs. BCA-1 was chemically synthesized and tested for activity on murine pre–B cells 300-19 transfected with BLR1 and on human blood B lymphocytes. In transfected cells, BCA-1 induced chemotaxis and Ca2+ mobilization demonstrating that it acts via BLR1. Under the same conditions, no activity was obtained with 10 CXC and 19 CC chemokines, lymphotactin, neurotactin/fractalkine and several other peptide ligands. BCA-1 was also a highly effective attractant for human blood B lymphocytes (which express BLR1), but was inactive on freshly isolated or IL-2–stimulated T lymphocytes, monocytes, and neutrophils. In agreement with the nomenclature rules for chemokine receptors, we propose the term CXCR5 for BLR1. Together with the observed disturbance of B cell colonization in BLR1/ CXCR5-deficient mice, the present results indicate that chemotactic recruitment by locally produced BCA-1 is important for the development of B cell areas of secondary lymphoid tissues.

Human γδ T cells are considered to play a vital role in protective immunity through cytokine secretion and cytotoxic activity. We report that cells expressing the Vγ2Vδ2 + –T cell receptor (Vδ2 + T cells) also display principal characteristics of professional antigen-presenting cells such as dendritic cells. Thus, when activated, these cells efficiently processed and displayed antigens and provided co-stimulatory signals sufficient for strong induction of naïve αβ T cell proliferation and differentiation. We suggest that, upon microbial activation, Vδ2 + T cells participate in the induction of adaptive immune responses and that these cells may be a useful tool in vaccine development and immunotherapy.

Several chemotactic agonists including interleukin-8 (IL-8) and related cytokines have been shown to activate and attract leukocytes via seven-transmembrane domain, GTP-binding protein-coupled receptors. A cDNA clone, LESTR, encoding a protein of 352 amino acids, corresponding to a novel receptor of this type, was isolated from a human blood monocyte cDNA library. The sequence of the deduced protein, LESTR (leukocyte-derived seven-transmembrane domain receptor), has 92.6% identity with that of a recently reported bovine neuropeptide Y (NPY) receptor, boLCR1 (Rimland, J., Xin, W., Sweetnam, P., Saijoh, K., Nestler, E. J., and Duman, R. S. (1991) Mol. Pharmacol. 40, 869-875). LESTR, however, is more similar (> 34%) to the IL-8 receptors, IL-8R1 and IL-8R2, than to several NPY receptors of different origin (< 20%). In the monocyte library, LESTR cDNA fragments were about 20 times as frequent as cDNA coding for IL-8R1 and IL-8R2, and much higher levels of LESTR- than IL-8R-specific mRNA were found in human blood neutrophils and lymphocytes. LESTR transcripts, by contrast, were low or undetectable in several neuroblastoma cell lines that are widely used to study NPY functions. Transfected cells expressing high levels of LESTR mRNA did not bind radiolabeled NPY, IL-8, NAP-2, GRO alpha, PF4, IP10, MCP-1, MCP-3, MIP-1 alpha, HC14, I309, RANTES, C3a, or LTB4. NPY also failed to bind to neutrophils, monocytes, and lymphocytes, to elicit responses in vitro such as Ca2+ changes, shape change, chemotaxis, enzyme release, and the respiratory burst, and to induce leukocyte accumulation upon injection in rats and rabbits. Although the ligand for LESTR could not be identified among a large number of chemotactic cytokines, the high expression in white blood cells and the marked sequence relation to IL-8R1 and IL-8R2 suggest that LESTR may function in the activation of inflammatory cells.

Several studies have shown that CC chemokines attract T lymphocytes, and that CD45RO+, memory phenotype cells are considered to be the main responders. The results, however, have often been contradictory and the role of lymphocyte activation and proliferation has remained unclear. Using CD45RO+ blood lymphocytes cultured under different stimulatory conditions, we have now studied chemotaxis as well as chemokine receptor expression. Expression of the RANTES/MIP-1 alpha receptor (CC-CKR1) and the MCP-1 receptor (CC-CKR2) was highly correlated with migration toward RANTES, MCP-1, and other CC chemokines, and was strictly dependent on the presence of IL-2 in the culture medium. Migration and receptor expression were rapidly downregulated when IL-2 was withdrawn, but were fully restored when IL-2 was added again. The effect of IL-2 could be partially mimicked by IL-4, IL-10, or IL-12, but not by IL-13, IFN gamma, IL-1 beta, TNF-alpha, or by exposure to anti-CD3, anti-CD28 or phytohemagglutinin. Activation of fully responsive lymphocytes through the TCR/CD3 complex and CD28 antigen actually had the opposite effect. It rapidly downregulated receptor expression and consequent migration even in the presence of IL-2. In contrast to the effects on CC chemokine receptors, stimulation of CD45RO+ T lymphocytes with IL-2 neither induced the expression of the CXC chemokine receptors, IL8-R1 and IL8-R2, nor chemotaxis to IL-8. The prominent role of IL-2 in CC chemokine responsiveness of lymphocytes suggests that IL-2-mediated expansion is a prerequisite for the recruitment of antigen-activated T cells into sites of immune and inflammatory reactions.

Interleukin-8 (IL-8) is an inflammatory mediator that stimulates neutrophil migration and functional activation. Analogs of human IL-8 were chemically synthesized, purified, and compared with the full-length 72-residue synthetic IL-8 for their ability to stimulate neutrophil chemotaxis and exocytosis as measured by assaying for release of elastase, as well as their binding to specific receptors in competition assays. Analogs corresponding to the less abundant natural forms, 3-72, 4-72, and 77-residue IL-8, were evaluated and the 3-72 and 4-72 had 2-5-fold higher potencies, whereas the 77-residue IL-8 was 2-fold less potent. A major finding was that NH2-terminal residues 4, 5, and 6 were absolutely essential for IL-8 activity and receptor binding. Quantitative dissociation of elastase release and chemotaxis activity was detected with 5-72, which compared with 1-72, was 80-fold less potent in the elastase assay, but was only slightly less potent in stimulating chemotaxis. IL-8 6-72 lacked all the biological activities tested but had detectable receptor binding activity. The NH2-terminal peptide, AVLPRSAKEL, lacked activity and receptor binding, suggesting that the NH2-terminal region alone is not sufficient for function. Comparison of analogs shortened at the COOH terminus showed that potency was progressively reduced as the COOH-terminal residues were excluded. However activity was retained in an analog (1-51) with the entire COOH-terminal alpha helix and beta turn missing. A peptide corresponding to the COOH-terminal 22 residues, although inactive alone, synergized with the 1-51 analog in stimulating elastase release. The results suggest that the NH2-terminal residues 4, 5, and 6, which are disordered in the IL-8 solution structure, are directly involved in receptor binding, but the COOH-terminal alpha helix is probably important for stabilizing the three-dimensional structure. Other regions within residues 7-51 are also functionally important.