T cell activation requires that the cell meet increased energetic and biosynthetic demands. We showed that exogenous nutrient availability regulated the differentiation of naïve CD4(+) T cells into distinct subsets. Activation of naïve CD4(+) T cells under conditions of glutamine deprivation resulted in their differentiation into Foxp3(+) (forkhead box P3-positive) regulatory T (Treg) cells, which had suppressor function in vivo. Moreover, glutamine-deprived CD4(+) T cells that were activated in the presence of cytokines that normally induce the generation of T helper 1 (TH1) cells instead differentiated into Foxp3(+) Treg cells. We found that α-ketoglutarate (αKG), the glutamine-derived metabolite that enters into the mitochondrial citric acid cycle, acted as a metabolic regulator of CD4(+) T cell differentiation. Activation of glutamine-deprived naïve CD4(+) T cells in the presence of a cell-permeable αKG analog increased the expression of the gene encoding the TH1 cell-associated transcription factor Tbet and resulted in their differentiation into TH1 cells, concomitant with stimulation of mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) signaling. Together, these data suggest that a decrease in the intracellular amount of αKG, caused by the limited availability of extracellular glutamine, shifts the balance between the generation of TH1 and Treg cells toward that of a Treg phenotype.

CAR-T cells rest to get back in the race Chimeric antigen receptor (CAR)–T cells, which are engineered to target specific tumor antigens, are increasingly used as an immunotherapy. CAR-T cells have shown promising results in patients, particularly in hematologic cancers, but their anticancer activity can be limited by the onset of exhaustion and the loss of effectiveness. Weber et al. characterized the phenotypic and epigenomic changes associated with CAR-T cell exhaustion caused by continuous activity and the beneficial effects of transient rest periods (see the Perspective by Mamonkin and Brenner). The authors tested different approaches for providing these rest periods, such as using the drug dasatinib to temporarily suppress T cell activity, which helped to prevent exhaustion and improved antitumor activity in mouse models. Science , this issue p. eaba1786 ; see also p. 34

Summary

 The metabolic state of quiescent hematopoietic stem cells (HSCs) is an important regulator of self-renewal, but it is unclear whether or how metabolic parameters contribute to HSC lineage specification and commitment. Here, we show that the commitment of human and murine HSCs to the erythroid lineage is dependent upon glutamine metabolism. HSCs require the ASCT2 glutamine transporter and active glutamine metabolism for erythroid specification. Blocking this pathway diverts EPO-stimulated HSCs to differentiate into myelomonocytic fates, altering in vivo HSC responses and erythroid commitment under stress conditions such as hemolytic anemia. Mechanistically, erythroid specification of HSCs requires glutamine-dependent de novo nucleotide biosynthesis. Exogenous nucleosides rescue erythroid commitment of human HSCs under conditions of limited glutamine catabolism, and glucose-stimulated nucleotide biosynthesis further enhances erythroid specification. Thus, the availability of glutamine and glucose to provide fuel for nucleotide biosynthesis regulates HSC lineage commitment under conditions of metabolic stress.

Regulatable CAR platforms could circumvent toxicities associated with CAR-T therapy, but existing systems have shortcomings including leakiness and attenuated activity. Here, we present SNIP CARs, a protease-based platform for regulating CAR activity using an FDA-approved small molecule. Design iterations yielded CAR-T cells that manifest full functional capacity with drug and no leaky activity in the absence of drug. In numerous models, SNIP CAR-T cells were more potent than constitutive CAR-T cells and showed diminished T cell exhaustion and greater stemness. In a ROR1-based CAR lethality model, drug cessation following toxicity onset reversed toxicity, thereby credentialing the platform as a safety switch. In the same model, reduced drug dosing opened a therapeutic window that resulted in tumor eradication in the absence of toxicity. SNIP CARs enable remote tuning of CAR activity, which provides solutions to safety and efficacy barriers that are currently limiting progress in using CAR-T cells to treat solid tumors.

Introductory paragraph While CAR T cells have altered the treatment landscape for B cell malignancies, the risk of on-target, off-tumor toxicity has hampered their development for solid tumors because most target antigens are shared with normal cells 1,2 . Researchers have attempted to apply Boolean logic gating to CAR T cells to prevent on-target, off-tumor toxicity 3–7 ; however, a truly safe and effective logic-gated CAR has remained elusive 8 . Here, we describe a novel approach to CAR engineering in which we replace traditional ITAM-containing CD3ζ domains with intracellular proximal T cell signaling molecules. We demonstrate that certain proximal signaling CARs, such as a ZAP-70 CAR, can activate T cells and eradicate tumors in vivo while bypassing upstream signaling proteins such as CD3ζ. The primary role of ZAP-70 is to phosphorylate LAT and SLP-76, which form a scaffold for the propagation of T cell signaling. We leveraged the cooperative role of LAT and SLP-76 to engineer L ogic-gated I ntracellular N etwor K (LINK) CAR, a rapid and reversible Boolean-logic AND-gated CAR T cell platform that outperforms other systems in both efficacy and the prevention of on-target, off-tumor toxicity. LINK CAR will dramatically expand the number and types of molecules that can be targeted with CAR T cells, enabling the deployment of these powerful therapeutics for solid tumors and diverse diseases such as autoimmunity 9 and fibrosis 10 . In addition, this work demonstrates that the internal signaling machinery of cells can be repurposed into surface receptors, a finding that could have broad implications for new avenues of cellular engineering.

(Cell Stem Cell 15, 169–184; August 7, 2014) A reader has pointed out that, in Figure 4C and Figure 6G of our originally published manuscript, there is apparent duplication of some of the plots presented. Upon examination of the affected panels and the underlying original data, we discovered that in both instances there is indeed duplication resulting from inclusion of erroneous image files. In Figure 4C, the Gr1/Ter119 flow profile presented for the control nonanemic condition (PHZ−, 2-DG−, DON−) in the lower panel is a duplication of the profile for the PHZ+, 2-DG+, DON− condition, although the indicated gated percentages do correspond to the correct original data. We have corrected the figure by replacing the profile in the control panel with the correct data. In Figure 6G, the histograms presented for CD71 staining in the DON and DON + DMK conditions are inadvertent duplications of the corresponding histograms for CD36, shown immediately below. To correct this figure, we have replaced the indicated panels with the correct data for the CD71 staining. In both figures, all panels other than those specifically highlighted remain the same. These unfortunate oversights in figure assembly do not affect our underlying data or conclusions. We apologize for any confusion that these issues have caused, and we wish to thank the anonymous reader for bringing them to our attention. The corrected figures are presented below and have been replaced in the versions of the manuscript that are available online.Figure 6Glutamine-Dependent Nucleotide Biosynthesis Is a Rate-Limiting Step in EPO-Induced Erythroid Differentiation of Human Hematopoietic ProgenitorsView Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) Glucose and Glutamine Metabolism Regulate Human Hematopoietic Stem Cell Lineage SpecificationOburoglu et al.Cell Stem CellJune 19, 2014In BriefMetabolite availability regulates stem cell differentiation, influencing lineage decisions during periods of in vivo metabolic stress. Oburoglu et al. show that erythroid differentiation requires glucose and glutamine metabolism and that HSCs are diverted to a myelomonocytic fate under restrictive conditions. Full-Text PDF Open Archive

BackgroundOutcomes are poor for patients with large B-cell lymphoma who relapse after CD19-directed chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy (CAR19). CD22 is a nearly universally expressed B-cell surface antigen and the efficacy of a CD22-directed CAR T-cell therapy (CAR22) in large B-cell lymphoma is unknown, which was what we aimed to examine in this study.MethodsIn this single centre, open-label, dose-escalation phase 1 trial, we intravenously administered CAR22 at two dose levels (1 million and 3 million CAR22-positive T cells per kg of bodyweight) to adult patients (aged ≥18 years) who relapsed after CAR19 or had CD19-negative large B-cell lymphoma. The primary endpoints were manufacturing feasibility, safety measured by the incidence and severity of adverse events and dose-limiting toxicities, and identification of the maximum tolerated dose (ie, the recommended phase 2 dose). This study is registered with ClinicalTrials.gov (NCT04088890) and is active, but closed for enrolment.FindingsFrom Oct 17, 2019, to Oct 19, 2022, a total of 41 patients were assessed for eligibility; however, one patient withdrew. 40 patients underwent leukapheresis and 38 (95%) had CAR T-cell products manufactured successfully. The median age was 65 years (range 25–84), 17 (45%) were women, 32 (84%) had elevated pretreatment lactate dehydrogenase, 11 (29%) had refractory disease to all previous therapies, and patients had received a median of four lines of previous therapy (range 3–8). Of the 38 patients treated, 37 (97%) had relapsed after previous CAR19. The identified maximum tolerated dose was 1 million CAR T cells per kg. Of 29 patients who received the maximum tolerated dose, no patients developed a dose-limiting toxicity or grade 3 or higher cytokine release syndrome, immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome, or immune effector cell-associated haemophagocytic lymphohistiocytosis-like syndrome.InterpretationThis trial identifies CD22 as an immunotherapeutic target in large B-cell lymphoma and demonstrates the durable clinical activity of CAR22 in patients with disease progression after CAR19 therapy. Although these findings are promising, it is essential to recognise that this is a phase 1 dose-finding study. Further investigations are warranted to establish the long-term efficacy and to delineate the patient subgroups that will derive the most benefit from this therapeutic approach.FundingNational Cancer Institute, National Institutes of Health, Stanford Cancer Institute, Leukemia & Lymphoma Society, Parker Institute for Cancer Immunotherapy, Lymph & Co, and the European Hematology Association.

Adenosine (Ado) mediates immune suppression in the tumor microenvironment and exhausted CD8

Abstract Adoptive cell therapy (ACT) has proven to be highly effective in treating blood cancers such as B cell malignancies, but traditional approaches to ACT are poorly effective in treating the multifarious solid tumors observed clinically. Locoregional cell delivery methods have shown promising results in treating solid tumors compared to standard intravenous delivery methods, but the approaches that have been described to date have several critical drawbacks ranging from complex manufacturing and poor modularity to challenging adminstration. In this work, we develop a simple-to-implement self-assembled and injectable hydrogel material for the controlled co-delivery of CAR-T cells and stimulatory cytokines that improves treatment of solid tumors. We evaluate a range of hydrogel formulations to optimize the creation of a transient inflammatory niche that affords sustained exposure of CAR-T cells and cytokines. This facile approach yields increased CAR-T cell expansion, induces a more tumor-reactive CAR-T phenotype, and improves efficacy in treating solid tumors in mice.

Abstract Adoptive T cell immune therapies mediate impressive clinical benefit in a fraction of patients, but anti-tumor effects are often limited by inadequate T cell potency. To identify genes limiting T cell effector function, we conducted genome-wide CRISPR knock-out screens in human primary CAR-T cells. The top hits were MED12 and CCNC , components of the cyclin-dependent kinase (CDK) module of the Mediator complex, an evolutionarily conserved regulator of gene transcription. MED12 or CCNC deficient CAR-T cells manifest increased expansion, cytokine production, metabolic fitness, effector function, anti-tumor activity and reduced terminal effector differentiation. Chemical inhibition of CDK8/19 kinase activity recapitulated some features of genetic loss of MED12 , including increased T cell expansion. MED12 deficient CAR-T cells showed widespread but selective increases in chromatin accessibility, MED1 chromatin occupancy, and H3K27 acetylation at enhancers used by transcription factors playing a critical role in T cell fate, including several STAT and AP1 family members. The most pronounced enhancement was observed for STAT5 which manifested as increased sensitivity to IL-2 in MED12 deficient T cells. These results link Mediator induced transcriptional coactivation with T cell effector programming and identify the CDK module as a target for enhancing the potency of anti-tumor T cell responses. One Sentence Summary The Mediator kinase module is a primary regulator of T cell differentiation, and genetic or small molecule-based inhibition of this module enhances effector T cell potency.