Introductory Paragraph In many species, including Arabidopsis, heterochromatin often comprises repetitive DNA elements, such as arrays of ribosomal DNA (rDNA). Repetitive regions pose a risk in meiosis since recombination between them can lead to gross genomic rearrangements. However, meiotic recombination at rDNA arrays and other heterochromatic repeat regions is blocked by not well understood mechanisms. Here, we have identified RAD21.2, an α-kleisin subunit of cohesin, as a repressor of meiotic recombination at the rDNA regions in Arabidopsis. We show that RAD21.2 co-localizes with heterochromatic factors and is specifically enriched at rDNA repeats, which are devoid of the meiosis specific α-kleisin REC8, needed for recombination. Knocking down RAD21.2, we find that REC8 moves into the nucleolus organizing regions (NORs), where we see an increase of RAD51 recombinase foci numbers. Concomitantly, we find extensive rearrangements of the NORs and the offspring of these plants have large variation in rDNA copy numbers demonstrating that RAD21.2 is necessary for transgenerational genome stability. One-Sentence Summary The cohesin component RAD21.2 represses meiotic recombination and by that contributes to genome stability over generations.

Abstract Type 3 secretion systems (T3SS) are essential virulence factors of numerous bacterial pathogens and inject effector proteins into host cells. The needle-like T3SS machinery consists of more than 20 components, has a length of around 100 nm and a diameter of up to 30 nm according to EM studies. Its intrabacterial components are highly dynamic and in permanent exchange with other bacterial structures. Therefore, a temporally and spatially resolved visualization of the T3SS using fluorescence microscopy techniques has been challenging. In the present study, novel labeling strategies were combined with super-resolution microscopy such as STED, STORM and MINFLUX. MINFLUX nanoscopy allowed to visualize components of the T3SS machinery such as the dynamic sorting platform component YscL and the extrabacterial pore protein YopD at unprecedented resolutions. The presented results represent the basis for an in depth investigation of T3SS structure and function and therefore gain new insights into the infection process of human pathogens in order to develop novel treatment and prevention strategies.

Abstract Here we present a novel fluorescence microscopy concept which enables a direct integration of Super-Resolution Microscopy (SRM) approaches (SIM/Nanosizing, STED, SMLM, MINFLUX, SIMFLUX) into microscopy systems with working distances (WD) up to the multicentimeter range while still allowing nanometer scale resolution at selected sites. This becomes possible by a “synthetic aperture” illumination mode with multiple, constructively interfering excitation beams positioned in a “Ring-Array” arrangement around a beam free interior zone containing instrumentation involved in complementary imaging modes. The feasibility of such a direct correlative microscopy method is validated by extensive numerical simulations; on the basis of these calculations, experimental implementation options are discussed. Such “Ring Array” illumination modes may be useful for various correlative microscopy methods, such as a direct combination of correlative light and electron microscopy in the same device (dCLEM); or a direct combination of low NA/large field-of-view widefield microscopy and super-resolution of selected sites in the same device (direct Correlative Opical Microscopy/dCOLM). Ring-Array supported correlative microscopy modes will open novel imaging perspectives in a variety of disciplines, from material sciences to biomedical applications.

Adeno-associated virus (AAV) is a promising in vivo gene delivery platform showing advantages in delivering therapeutic molecules to difficult or undruggable cells. However, natural AAV serotypes have insufficient transduction specificity and efficiency in kidney cells. Here, we developed an evolution-directed selection protocol for renal glomeruli and identified what we believe to be a new vector termed AAV2-GEC that specifically and efficiently targets the glomerular endothelial cells (GEC) after systemic administration and maintains robust GEC tropism in healthy and diseased rodents. AAV2-GEC-mediated delivery of IdeS, a bacterial antibody-cleaving proteinase, provided sustained clearance of kidney-bound antibodies and successfully treated antiglomerular basement membrane glomerulonephritis in mice. Taken together, this study showcases the potential of AAV as a gene delivery platform for challenging cell types. The development of AAV2-GEC and its successful application in the treatment of antibody-mediated kidney disease represents a significant step forward and opens up promising avenues for kidney medicine.

Abstract Biofilm formation shields Staphylococcus epidermidis from host defense mechanisms, contributing to chronic implant infections. Using wild-type S. epidermidis 1457, a PIA-negative mutant (1457-M10), and an eDNA-negative mutant (1457Δ atlE ), this study examined the influence of biofilm matrix components on human monocyte-derived macrophage (hMDM) interactions. The wild-type strain was resistant to phagocytosis and induced an anti-inflammatory response in hMDMs, while both mutants were more susceptible to phagocytosis and triggered a pro-inflammatory response. Removing eDNA from the 1457 biofilm matrix increased hMDM uptake and a pro-inflammatory reaction, whereas adding eDNA to the 1457Δ atlE mutant reduced phagocytosis and promoted an anti-inflammatory response. Inhibiting TLR9 enhanced bacterial uptake and induced a pro-inflammatory response in hMDMs exposed to wild-type S. epidermidis . This study highlights the critical role of eDNA in immune evasion and the central role of TLR9 in modulating macrophage responses, advancing the understanding of implant infections.

Type III secretion systems (T3SSs) are essential virulence factors of numerous bacterial pathogens. Upon host cell contact the T3SS machinery - also named injectisome - assembles a pore complex/translocon within host cell membranes that serves as an entry gate for the bacterial effectors. Whether and how translocons are physically connected to injectisome needles, whether their phenotype is related to the level of effector translocation and which target cell factors trigger their assembly have remained unclear. We employed the superresolution fluorescence microscopy techniques Stimulated Emission Depletion (STED) and Structured Illumination Microscopy (SIM) as well as immunogold electron microscopy to visualize Y. enterocolitica translocons during infection of different target cell types. Thereby we were able to resolve translocon and needle complex proteins within the same injectisomes and demonstrate that these fully assembled injectisomes are generated in a prevacuole, a PI(4,5)P2 enriched host cell compartment inaccessible to large extracellular proteins like antibodies. Furthermore, the putatively operable translocons were produced by the yersiniae to a much larger degree in macrophages (up to 25% of bacteria) than in HeLa cells (2% of bacteria). However, when the Rho GTPase Rac1 was activated in the HeLa cells, uptake of the yersiniae into the prevacuole, translocon formation and effector translocation were strongly enhanced reaching the same levels as in macrophages. Our findings indicate that operable T3SS translocons can be visualized as part of fully assembled injectisomes with superresolution fluorescence microscopy techniques. By using this technology we provide novel information about the spatiotemporal organisation of T3SS translocons and their regulation by host cell factors.

Extracellular vesicles (EVs) are important means of intercellular communication and a potent tool for regenerative therapy. In ischemic stroke, transient blockage of a brain artery leads to a lack of glucose and oxygen in the affected brain tissue, provoking neuronal death by necrosis in the core of the ischemic region. The fate of neurons in the surrounding penumbra depends on the stimuli, including EVs, received during the following hours. A detailed characterization of such stimuli is crucial not only for understanding stroke pathophysiology but also for new therapeutic interventions. In the present study, we characterize the EVs in mouse brain under physiological conditions and 24h after induction of transient ischemia in mice. We show that, in steady-state conditions, microglia are the main source of small EVs (sEVs) whereas after ischemia, the main EV population originates from astrocytes. Moreover, sEVs presented high amounts of the prion protein (PrP) which were increased after stroke. Conspicuously, sEVs were particularly enriched in a truncated PrP fragment (PrP-C1). Because of similarities between PrP-C1 and certain viral surface proteins, we studied the cellular uptake of brain-derived sEVs from mice lacking (PrP-KO) or containing PrP (WT). We show that PrP-KO-EVs are rapidly taken up by neurons and colocalize with lysosomes. Although eventually WT-EVs are also found in lysosomes, the amount taken up by neurons is significantly higher for PrP-KO-EVs. Likewise, microglia and astrocytes were also engulfing PrP-KO-sEVs more efficiently than WT-sEVs. Our results provide information on the relative contribution of brain cell types to the sEV pool in mice and indicate that increased release of sEVs by astrocytes together with elevated levels of PrP in sEVs may play a role in intercellular communication at early stages after stroke. In addition, amounts of PrP (and probably PrP-C1) in brain sEVs seem to contribute to their cellular uptake.

Amphisomes are transient organelles that derive from fusion of autophagosomes with late endosomes. They rapidly transform into degradative autolysosomes, whereas non-degradative roles of the autophagic pathway have been barely described. Here we show that in neurons BDNF/TrkB receptor bearing Rab7 / Light chain 3 (LC3) - positive amphisomes signal at presynaptic boutons during retrograde trafficking to the soma. Local signaling and inward transport essentially require the Rap GTPase-activating (RapGAP) protein SIPA1L2, which directly binds to TrkB and Snapin to connect TrkB-containing amphisomes to dynein. Association with LC3 regulates the RapGAP activity of SIPA1L2 and thereby retrograde trafficking. Following induction of presynaptic plasticity amphisomes dissociate from dynein at boutons, and this enables local signaling and promotes transmitter release. Accordingly, sipa1l2 knockout mice show impaired BDNF-dependent presynaptic plasticity. Collectively, the data suggest that TrkB-signaling endosomes are in fact amphisomes that during retrograde transport have local signaling capacity in the context of presynaptic plasticity.