Abstract Continuing advances in cryo-electron microscopy (cryo-EM) demonstrate the promise it holds for revealing biological structures at chemical resolution, in which noncovalent interactions, RNA and protein modifications, and solvation can be modeled accurately. At present, the best cryo-EM-derived models of the bacterial ribosome are of the large (50S) ribosomal subunit with effective global resolutions of 2.4-2.5 Å, based on map-to-model Fourier shell correlation (FSC). Here we present a model of the E. coli 70S ribosome with an effective global resolution of 2.0 Å, based on maps showcasing unambiguous positioning of residues, their detailed chemical interactions, and chemical modifications. These modifications include the first examples of isopeptide and thioamide backbone substitutions in ribosomal proteins, the former of which is likely conserved in all domains of life. The model also defines extensive solvation of the small (30S) ribosomal subunit for the first time, as well as interactions with A-site and P-site tRNAs, mRNA, and the antibiotic paromomycin. The high quality of the maps now allows a deeper phylogenetic analysis of ribosomal components, and identification of structural conservation to the level of solvation. The maps and models of the bacterial ribosome presented here should enable future structural analysis of the chemical basis for translation, and the development of robust tools for cryo-EM structure modeling and refinement.

Abstract As genetic code expansion advances beyond L-α-amino acids to backbone modifications and new polymerization chemistries, the field faces an increasingly broad challenge to discover what the ribosome can accommodate. Although the E. coli ribosome tolerates non-L-α-amino acids in vitro , few structural insights are available, and the boundary conditions for efficient bond formation are unknown. We describe a 2.1 Å cryo-EM structure of the E. coli ribosome containing well-resolved α-amino acid monomers coupled with a computational approach for which energy surface minima produced by metadynamics trend in agreement with established incorporation efficiencies. Reactive monomers across diverse structural classes favor a conformational space characterized by an A-site nucleophile to P-site carbonyl distance of < 4 Å and a Bürgi-Dunitz angle of 90-110°. Monomers whose free energy minima fall outside these regions do not react. Application of this model should accelerate the in vivo and in vitro ribosomal synthesis and application of sequence-defined, non-peptide heterooligomers.

Ribosome engineering has emerged as a promising field in synthetic biology, particularly concerning the production of new sequence-defined polymers. Mutant ribosomes have been developed that improve the incorporation of several non-standard monomers including D-amino acids, dipeptides, and β-amino acids into polypeptide chains. However, there remains little mechanistic understanding of how these ribosomes catalyze incorporation of these new substrates. Here we probed the properties of a mutant ribosome-P7A7-evolved for better in vivo β-amino acid incorporation through in vitro ; biochemistry and cryo-electron microscopy. Although P7A7 is a functional ribosome in vivo , it is inactive in vitro ,and assembles poorly into 70S complexes. Structural characterization revealed large regions of disorder in the peptidyl transferase center and nearby features, suggesting a defect in assembly. Comparison of RNA helix and ribosomal protein occupancy with other assembly intermediates revealed that P7A7 is stalled at a late stage in ribosome assembly, explaining its weak activity. These results highlight the importance of ensuring efficient ribosome assembly during ribosome engineering towards new catalytic abilities.

ABSTRACT Ribosomes serve as the universally conserved translators of the genetic code into proteins and must support life across temperatures ranging from below freezing to above the boiling point of water. Ribosomes are capable of functioning across this wide range of temperatures even though the catalytic site for peptide bond formation, the peptidyl transferase center, is nearly universally conserved. Peptide bond formation by the ribosome requires correct positioning of the 3’ s-end of the aminoacylated tRNA (aa-tRNA) substrate, which is aided by an RNA hairpin in the ribosomal RNA (rRNA) of the large subunit, termed the A loop. Here we find that Thermoproteota, a phylum of thermophilic Archaea, substitute cytidine for uridine at large subunit rRNA positions 2554 and 2555 ( Escherichia coli numbering) in the A loop, immediately adjacent to the binding site for the 3′-end of A-site tRNA. We show by cryo-EM that E. coli ribosomes with uridine to cytidine mutations at these positions retain the proper fold and post-transcriptional modification of the A loop. Additionally, these mutations do not exert a dominant negative effect on cellular growth, protect the large ribosomal subunit from thermal denaturation, and increase the mutational robustness of nucleotides in the peptidyl transferase center. This work identifies sequence variation in the peptidyl transferase center of the archaeal ribosome that likely confers stabilization of the ribosome at high temperatures and develops a stable mutant bacterial ribosome that can act as a scaffold for future ribosome engineering efforts.

Analysis of images of biotinylated Escherichia coli 70S ribosome particles, bound to streptavidin affinity grids, demonstrates that the image-quality of particles can be predicted by the image-quality of the monolayer crystalline support film. The quality of the Thon rings is also a good predictor of the image-quality of particles, but only when images of the streptavidin crystals extend to relatively high resolution. When the estimated resolution of streptavidin was 5 Å or worse, for example, the ribosomal density map obtained from 22,697 particles went to only 9.5 Å, while the resolution of the map reached 4.0 Å for the same number of particles, when the estimated resolution of streptavidin crystal was 4 Å or better. It thus is easy to tell which images in a data set ought to be retained for further work, based on the highest resolution seen for Bragg peaks in the computed Fourier transforms of the streptavidin component. The refined density map obtained from 57,826 particles obtained in this way extended to 3.6 Å, a marked improvement over the value of 3.9 Å obtained previously from a subset of 52,433 particles obtained from the same initial data set of 101,213 particles after 3-D classification. These results are consistent with the hypothesis that interaction with the air-water interface can damage particles when the sample becomes too thin. Streptavidin monolayer crystals appear to provide a good indication of when that is the case.

Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) are a rapidly expanding and largely untapped class of natural products with various biological activities. Linear azol(in)e-containing peptides (LAPs) comprise a subclass of RiPPs that display an outstanding diversity of mechanisms of action while sharing common structural features. Here, we report the discovery of a new LAP biosynthetic gene cluster in the genome of Rhizobium sp. Pop5, which encodes the precursor peptide and modification machinery of phazolicin (PHZ) – an extensively modified peptide exhibiting narrow-spectrum antibacterial activity against some symbiotic bacteria of leguminous plants belonging to the Rhizobiales. PHZ inhibits prokaryotic translation through the obstruction of the passage of the nascent peptide through the ribosome exit channel. The cryo-EM structure of the Escherichia coli ribosome with bound PHZ revealed that the drug interacts with the 23S rRNA and ribosomal proteins uL4 and uL22 and obstructs the exit tunnel in a way that is distinct from other compounds blocking the exit channel. We show that the sequence of uL4 ribosomal protein loop involved in PHZ binding determines the species-specificity of antibiotic interaction with its target. PHZ and its predicted homologs from other bacterial species expand the known diversity of LAPs and may be used in the future as biocontrol agents for the needs of agriculture.

We describe a rapid and convenient method of growing streptavidin (SA) monolayer crystals directly on holey-carbon EM grids. As expected, these SA monolayer crystals retain their biotin-binding function and crystalline order through a cycle of embedding in trehalose and, later, its removal. This fact allows one to prepare, and store for later use, EM grids on which SA monolayer crystals serve as an affinity substrate for preparing specimens of biological macromolecules. In addition, we report that coating the lipid-tail side of trehalose-embedded monolayer crystals with evaporated carbon appears to improve the consistency with which well-ordered, single crystals are observed to span over entire, 2 μm holes of the support films. Randomly biotinylated 70 S ribosomes are used as a test specimen to show that these support films can be used to obtain a high-resolution cryo-EM structure.