Abstract Arthropod-borne viruses of the alphavirus and flavivirus genera are human pathogens of significant concern, and currently, no specific antiviral treatment is available for these viruses. This study has elucidated the antiviral mechanisms of natural small molecules against the dengue (DENV) and chikungunya virus (CHIKV). Herbacetin (HC) and Caffeic acid phenethyl ester (CAPE) depleted polyamine levels in Vero cells, which has been demonstrated by thin-layer chromatography (TLC). As polyamines play an essential role in the replication and transcription of RNA viruses, the depletion of polyamines by HC and CAPE was anticipated to inhibit the virus replication. To test this hypothesis, HC and CAPE were evaluated for antiviral activities using a cell-based virus yield assay by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR), plaque reduction assay, and immunofluorescence assay (IFA). HC and CAPE displayed potent inhibition with EC 50 of 463 nM and 0.417 nM for CHIKV and 8.5 µM and 1.15 µM for DENV, respectively. However, the addition of exogenous polyamines did not ultimately rescue the virus titer in both CHIKV and DENV-infected cells. This finding suggested additional antiviral mechanisms for HC and CAPE. Further, in silico analysis revealed that HC and CAPE may directly target the viral methyltransferases (MTase) of CHIKV and DENV. The inhibition of virus-specific MTases by HC and CAPE was confirmed using purified viral MTase of CHIKV and DENV. Altogether, the dual targeting of the host pathway and the viral MTase using potent natural antiviral molecules is expected to facilitate the development of effective biological therapies. IMPORTANCE Vector-borne diseases caused by DENV and CHIKV has a catastrophic impact on human health worldwide. There are no effective vaccines and antiviral drugs present in the market till date against these viruses. In the present study, natural small molecules have been identified as antivirals against DENV and CHIKV. These molecules directly inhibit the virus and impede the synthesis of essential host molecules required for efficient virus replication. Hence, these broad-spectrum antivirals have high therapeutic potential.

Emerging variants of SARS-CoV-2 still threaten the effectiveness of currently deployed vaccines, and antivirals can prove to be an effective therapeutic option for attenuating it. The papain-like protease (PLpro) is an attractive target due to its sequence conservation and critical role in the replication and pathogenesis of SARS-CoV-2. PLpro also plays very important role in modulation of host immune responses by deubiquitinating (DUBs) or deISGylating host proteins. Thus, targeting PLpro serves as a two-pronged approach to abate SARS-CoV-2. Due to its structural and functional similarities with the host DUB enzymes, an in-house library of DUB inhibitors was constituted in this study. Five promising compounds exhibiting high binding affinities with the substrate binding site of PLpro were identified from a library of 81 compounds with in silico screening, docking, and simulation studies. Interestingly, lithocholic acid, linagliptin, teneligliptin, and flupenthixol significantly inhibited the proteolytic activity of PLpro. Each of these compounds abrogated in vitro replication of SARS-CoV-2 with EC50 values in low micromolar range, when tested in Vero cells, HEK293T-ACE2, and A549-ACE2 cells. In addition, crystal structure of SARS-CoV-2 PLpro and its complex with inhibitors have been determined that revealed their inhibitory mechanism. The findings of this study provide the proof-of-principle that the DUB inhibitors hold high potential as a new class of therapeutics against SARS-CoV-2. Additionally, this is the first study that has opened a new avenue towards not only targeting PLpro active site but also simultaneously directing towards restoration of antiviral immune response of the host for deterring SARS-CoV-2.

Chikungunya virus (CHIKV) is frequently recurring in recent decades, causing outbreaks worldwide in tropical and subtropical regions. The re-emergence of CHIKV poses a substantial risk to human health as no efficacious medical countermeasures are available to curb new outbreaks effectively. The interaction of the cytoplasmic domain of E2 (cdE2) with the conserved hydrophobic pocket of capsid protein (CP) is crucial for virus budding. Thus, compounds capable of disrupting this interaction can act as effective antiviral drugs. Here, we identified that efavirenz shows interactions with CP (KD = 6.22 μM), thereby it may disrupt the cdE2-CP interaction, making it a potential candidate for developing an antiviral against CHIKV. Subsequently, anti-CHIKV activity of efavirenz by an in-vitro cell culture-based antiviral assay, immunofluorescence assay (IFA), and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) was investigated. These studies demonstrated dose-dependent robust anti-CHIKV activity of efavirenz at low micromolar concentration (EC50 = 1.33 μM). To demonstrate broad anti-alphavirus activity of efavirenz, its inhibitory activity against Sindbis virus (SINV) was detected. Interestingly, efavirenz also inhibited the replication of SINV at low micromolar range (EC50 = 0.7 μM). Efavirenz is used for the treatment of HIV infection, here present study indicate that it can be repurposed against CHIKV infection as it has good oral bioavailability, long half-life and affordable low cost indicate great potential as a drug to treat CHIKV-infected individuals and to curb outbreaks in the initial phase.

Type1 Non-specific Lipid Transfer Protein (CsLTP1) from Citrus sinensis is a small cationic protein possessing a long tunnel-like hydrophobic cavity. CsLTP1 performing membrane trafficking of lipids is a promising candidate for developing a potent drug delivery system. The present work includes in-silico studies and the evaluation of drugs binding to CsLTP1 using biophysical techniques along with the investigation of CsLTP1's ability to enhance the efficacy of drugs employing cell-based bioassays. The in-silico investigations identified Panobinostat, Vorinostat, Cetylpyridinium Chloride, and Fulvestrant with higher affinities and stability of binding to the hydrophobic pocket of CsLTP1. SPR studies revealed strong binding affinities of anticancer drugs, Panobinostat (K

Abstract SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) complex consisting of nsp12, nsp7, and nsp8 as the key enzyme for viral genome replication and is a proven antiviral drug target. In this study, molecular interactions of nsp7 and nsp8 with nsp12 and the active site of nsp12 were coterminously targeted using in-silico screening of small molecule libraries to identify potential antivirals. Surface plasmon resonance (SPR) based assay using purified nsp7 and nsp8 proteins was developed, and the binding of identified molecules to targets was validated. The antiviral efficacy of identified small molecules was evaluated using cell-based assays, and potent antiviral effect with EC 50 values of 0.56 μM, 0.73 μM, and 2.8 μM was demonstrated by fangchinoline, cepharanthine, and sennoside B, respectively. Further in vivo, investigation using hACE2 mice is being conducted. This is the first study that targets multiple sites in the RdRp complex of SARS-CoV-2 using a structure-based molecular repurposing approach and suggests potential therapeutic options for emerging variants of SARS-CoV-2.