Cardiomyocytes are subjected to the intense mechanical stress and metabolic demands of the beating heart. It is unclear whether these cells, which are long-lived and rarely renew, manage to preserve homeostasis on their own. While analyzing macrophages lodged within the healthy myocardium, we discovered that they actively took up material, including mitochondria, derived from cardiomyocytes. Cardiomyocytes ejected dysfunctional mitochondria and other cargo in dedicated membranous particles reminiscent of neural exophers, through a process driven by the cardiomyocyte’s autophagy machinery that was enhanced during cardiac stress. Depletion of cardiac macrophages or deficiency in the phagocytic receptor Mertk resulted in defective elimination of mitochondria from the myocardial tissue, activation of the inflammasome, impaired autophagy, accumulation of anomalous mitochondria in cardiomyocytes, metabolic alterations, and ventricular dysfunction. Thus, we identify an immune-parenchymal pair in the murine heart that enables transfer of unfit material to preserve metabolic stability and organ function.Video Abstracthttps://www.cell.com/cms/asset/46565560-674e-41de-80b4-3f0988fd287f/mmc7.mp4Loading ...(mp4, 11.65 MB) Download video

Abstract The protein titin determines cardiomyocyte contraction and truncating variants in the titin gene ( TTN ) are the most common cause of dilated cardiomyopathy (DCM). Different to truncations, missense variants in TTN are currently classified as variants of uncertain significance due to their high frequency in the population and the absence of functional annotation. Here, we report the regulatory role of conserved, mechanically active titin cysteines, which, contrary to current views, we uncover to be reversibly oxidized in basal conditions leading to isoform- and force-dependent modulation of titin stiffness and dynamics. Building on our functional studies, we demonstrate that missense mutations targeting a conserved titin cysteine alter myocyte contractile function and cause DCM in humans. Our findings have a direct impact on genetic counselling in clinical practice. One sentence summary Mutations targeting cysteines key to the mechanoredox control of titin cause human dilated cardiomyopathy

Abstract The mechanical properties of the extracellular matrix (ECM) determine cell differentiation, proliferation and migration through mechanoresponsive proteins including YAP. However, how different mechanical signals cooperate, synergize or compete to steer cell behavior remains poorly understood. Here, we have examined competition between the two major ECM mechanical cues, i.e. rigidity, which activates cell mechanosensing, and viscous energy dissipation, which reduces stiffness blunting cell mechanotransduction. To trigger competition, we have engineered protein hydrogels allowing concomitant modulation of stiffness and viscosity by mechanisms characteristic of native ECM. Culturing cells on these hydrogels, we have found that substrate energy dissipation attenuates YAP mechanosensing prevailing over stiffness cues. Hampered YAP activation on more dissipative substrates correlates with faster actin flow and smaller focal adhesions. Mechanistically, inhibition of actomyosin contractility reverses the outcome of the competition between rigidity and energy dissipation. Our results highlight the dominating contribution of substrate viscosity to the biology of the cell.

ABSTRACT Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a disease of the myocardium caused by mutations in sarcomeric proteins with mechanical roles, such as the molecular motor myosin. Around half of the HCM-causing genetic variants target contraction modulator cardiac myosin-binding protein C (cMyBP-C), although the underlying pathogenic mechanisms remain unclear since many of these mutations cause no alterations in protein structure and stability. As an alternative pathomechanism, here we have examined whether pathogenic mutations perturb the nanomechanics of cMyBP-C, which would compromise its modulatory mechanical tethers across sliding actomyosin filaments. Using single-molecule atomic force spectroscopy, we have quantified mechanical folding and unfolding transitions in cMyBP-C mutant domains. Our results show that domains containing mutation R495W are mechanically weaker than wild-type at forces below 40 pN, and that R502Q mutant domains fold faster than wild-type. None of these alterations are found in control, non-pathogenic variants, suggesting that nanomechanical phenotypes induced by pathogenic cMyBP-C mutations contribute to HCM development. We propose that mutation-induced nanomechanical alterations may be common in mechanical proteins involved in human pathologies.

Abstract Vitellogenin (Vg) is a conserved protein used by nearly all oviparous animals to produce eggs. It is also pleiotropic and performs functions in oxidative stress resistance, immunity, and, in honey bees, behavioral development of the worker caste. It has remained enigmatic how Vg affects multiple traits. Here, we asked whether Vg enters the nucleus and acts via DNA-binding. We used immunohistology, cell fractionation and cell culturation to show that a structural subunit of honey bee Vg translocates into cell nuclei. We then demonstrated Vg-DNA binding theoretically and empirically with prediction software and chromatin immunoprecipitation with sequencing (ChIP-seq), finding binding sites at genes influencing immunity and behavior. Finally, we investigated the immunological and enzymatic conditions affecting Vg cleavage and nuclear translocation, and constructed a 3D structural model. Our data are the first to show Vg in the nucleus and suggests a new fundamental regulatory role for this ubiquitous protein.

Abstract Single-molecule methods using recombinant proteins have generated transformative hypotheses on how mechanical forces are generated and sensed in biological tissues. However, testing these mechanical hypotheses on native molecules in their natural environment remains inaccessible to conventional genetics, biophysics and molecular biology tools. To address these limitations, here we demonstrate a genetically engineered knock-in mouse model carrying a HaloTag-TEV insertion in the protein titin, the main determinant of myocyte stiffness. Using our system, we have specifically severed the titin filament by digestion with TEV protease, and found that the response of muscle fibers to length changes requires mechanical transduction through titin’s intact polypeptide chain. HaloTag-based covalent tethering has enabled directed examination of the dynamics of titin under 1-100 pN forces using recently developed magnetic tweezers. At pulling forces lower than 10 pN, titin domains are readily recruited to the unfolded state, and produce 41.5 zJ mechanical work during refolding. Our results support an active role of titin in muscle contraction in coordination with actomyosin motors. Insertion of the HaloTag-TEV cassette in proteins with mechanical roles opens new grounds to explore the molecular basis of cellular force generation, mechanosensing and mechanotransduction.

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Public grant(s) – EU funding. Main funding source(s): We acknowledge funding from Ministerio de Ciencia e Innovación (Madrid, Spain) through grant FJC2021 047055-I and European Research Council (ERC) through grant H2020-ERC-2020-COG (ProtMechanics-Live). Background/Introduction Stresses exerted during myocardial contraction and relaxation cycles are mainly braced by mechanical proteins located in the extracellular matrix (ECM) and cardiomyocytes (CMs). Titin (TTN) is a gigantic protein that scaffolds the sarcomere (i.e. the basic unit of contraction). Since most of the CM cytoskeleton is occupied by sarcomeres, titin is an essential structural hub for the maintenance of a homeostatic level of mechanical tension. Purpose It has been shown that mechanical disruption of the ECM affects the equilibrium forces between CMs and the ECM, leading to morphological changes in sarcomeres. However, potential alteration of tensional homeostasis resulting from defective mechanics of CM proteins remains unknown due to the lack of tools for in vivo studies. Therefore, the aim of this study is to explore the in vivo response of the myocardium to the abrupt cessation of the mechanical properties of titin. Methods For this purpose, we have experimentally challenged CMs to a tensional unloading by means of a titin cleavage model (TEVs-TTN) [1], both in vitro, using neonatal CM (NMCM), and in vivo. In this model, a cassette with a tobacco etch virus protease (TEVp) recognition sequence has been included in the I-band of titin. Transducing TEVp with adeno-associated virus (myoAAV), we were able to cleave titin in living CMs, ceasing only its mechanical properties. Samples were analyzed using an array of techniques such as histology, immunofluorescence and bulk and single-nucleus RNAseq. Results Our results show that while in NMCM we obtain a complete titin cleavage, in vivo we observe mosaic expression of TEVp and no more than 30% cleavage of the protein. In both cases, TEVp expression in TEVs-TTN does not affect cell viability. However, mild myocardial titin cleavage leads to a fibrotic response in less than six days, characterized by an increase in interstitial collagen and an expansion of cardiac fibroblasts population. Transcriptional and phospo-SMAD2/3 analysis results suggest that this fibrotic response occurs without activation of the canonical TGFβ pathway. Conclusion Taken together, our results suggest that the loss of titin mechanical-structural function in cardiomyocytes derived from the cleavage of a single peptide bond elicits a fast fibrotic compensatory response in the myocardium through intercellular communication with fibroblasts.

In the era of Next Generation Sequencing (NGS), genetic testing for inherited disorders identifies an ever-increasing number of variants whose pathogenicity remains unclear. These variants of uncertain significance (VUS) limit the reach of genetic testing in clinical practice. The VUS for Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM), the most common familial heart disease, constitute over 60% of entries for missense variants shown in ClinVar database. We have studied a novel VUS (c.1809T>G-p.I603M) in the most frequently mutated gene in HCM, MYBPC3, which codes for cardiac myosin-binding protein C (cMyBPC). Our determinations of pathogenicity integrate bioinformatics evaluation and functional studies of RNA splicing and protein thermodynamic stability. In silico prediction and mRNA analysis indicated no alteration of RNA splicing induced by the variant. At the protein level, the p.I603M mutation maps to the C4 domain of cMyBPC. Although the mutation does not perturb much the overall structure of the C4 domain, the stability of C4 I603M is severely compromised as detected by circular dichroism and differential scanning calorimetry experiments. Taking into account the highly destabilizing effect of the mutation in the structure of C4, we propose reclassification of variant p.I603M as likely pathogenic. Looking into the future, the workflow described here can be used to refine the assignment of pathogenicity of variants of uncertain significance in MYBPC3.

ABSTRACT The underlying genetic defect in most cases of dilated cardiomyopathy (DCM), a common inherited heart disease, remains unknown. Intriguingly, many patients carry single missense variants of uncertain pathogenicity targeting the giant protein titin, a fundamental sarcomere component. To explore the deleterious potential of these variants, we first solved the wild-type and mutant crystal structures of I21, the titin domain targeted by pathogenic variant p.C3575S. Although both structures are remarkably similar, the increase in hydrophilicity of deeply buried position 3575 strongly destabilizes the mutant domain, a scenario supported by molecular dynamics simulations and by biochemical assays that show no disulfide involving C3575. Prompted by these observations, we have found that thousands of similar hydrophilizing variants associate specifically with DCM. Hence, our results imply that titin domain destabilization causes DCM, a conceptual framework that not only informs pathogenicity assessment of gene variants but also points to therapeutic strategies counterbalancing protein destabilization.