The Hippo pathway plays a key role in organ size control by regulating cell proliferation and apoptosis in Drosophila . Although recent genetic studies have shown that the Hippo pathway is regulated by the NF2 and Fat tumor suppressors, the physiological regulations of this pathway are unknown. Here we show that in mammalian cells, the transcription coactivator YAP (Yes-associated protein), is inhibited by cell density via the Hippo pathway. Phosphorylation by the Lats tumor suppressor kinase leads to cytoplasmic translocation and inactivation of the YAP oncoprotein. Furthermore, attenuation of this phosphorylation of YAP or Yorkie (Yki), the Drosophila homolog of YAP, potentiates their growth-promoting function in vivo. Moreover, YAP overexpression regulates gene expression in a manner opposite to cell density, and is able to overcome cell contact inhibition. Inhibition of YAP function restores contact inhibition in a human cancer cell line bearing deletion of Salvador (Sav), a Hippo pathway component. Interestingly, we observed that YAP protein is elevated and nuclear localized in some human liver and prostate cancers. Our observations demonstrate that YAP plays a key role in the Hippo pathway to control cell proliferation in response to cell contact.

The Drosophila gene eyeless ( ey ) encodes a transcription factor with both a paired domain and a homeodomain. It is homologous to the mouse Small eye ( Pax-6 ) gene and to the Aniridia gene in humans. These genes share extensive sequence identity, the position of three intron splice sites is conserved, and these genes are expressed similarly in the developing nervous system and in the eye during morphogenesis. Loss-of-function mutations in both the insect and in the mammalian genes have been shown to lead to a reduction or absence of eye structures, which suggests that ey functions in eye morphogenesis. By targeted expression of the ey complementary DNA in various imaginal disc primordia of Drosophila , ectopic eye structures were induced on the wings, the legs, and on the antennae. The ectopic eyes appeared morphologically normal and consisted of groups of fully differentiated ommatidia with a complete set of photoreceptor cells. These results support the proposition that ey is the master control gene for eye morphogenesis. Because homologous genes are present in vertebrates, ascidians, insects, cephalopods, and nemerteans, ey may function as a master control gene throughout the metazoa.

How organ size is controlled in mammals is not currently understood. In Drosophila the Hippo signaling pathway functions to suppress growth in imaginal discs and has been suggested to control organ size. To investigate the role of hippo signaling in regulation of mammalian organ size we have generated conditional alleles of Sav1 , mst1 , and mst2 , orthologs of Drosophila Salvador and hippo , respectively. Specific deletion of both mst1 and mst2 in hepatocytes results in significantly enlarged livers due to excessive proliferation. By the age of 5–6 months, mst1/2 conditional mutant livers have multiple foci of liver tumors, indicating that the combined activities of mst1 and mst2 act as redundant tumor suppressors in hepatocytes. Similar findings were obtained with liver-specific deletion of Sav1 , a second core Hippo signaling component that facilitates activation of mst1 and mst2 . Tumors from sav1 mutants exhibited varied morphology, suggesting a mixed-lineage origin of tumor-initiating cells. Transcriptional profiling of liver tissues from both mst1/2 and sav1 conditional mutants revealed a network of Hippo signaling regulated genes with specific enrichment for genes involved in immune and inflammatory responses. Histological and immunological characterization of mst1/2 double mutant liver tissues revealed abundant accumulation of adult facultative stem cells termed oval cells in periductal regions. Because oval cells induction is commonly associated with liver injury and tumor formation, it is likely that these cells contribute to the enlarged livers and hepatomas that we observe in sav1 and mst1/2 mutants. Taken together, our results demonstrate that the Hippo signaling pathway is a critical regulator of mammalian liver growth and a potent suppressor of liver tumor formation.

Abstract The Hippo pathway plays a central role in tissue homoeostasis, and its dysregulation contributes to tumorigenesis. Core components of the Hippo pathway include a kinase cascade of MST1/2 and LATS1/2 and the transcription co-activators YAP/TAZ. In response to stimulation, LATS1/2 phosphorylate and inhibit YAP/TAZ, the main effectors of the Hippo pathway. Accumulating evidence suggests that MST1/2 are not required for the regulation of YAP/TAZ. Here we show that deletion of LATS1/2 but not MST1/2 abolishes YAP/TAZ phosphorylation. We have identified MAP4K family members—Drosophila Happyhour homologues MAP4K1/2/3 and Misshapen homologues MAP4K4/6/7—as direct LATS1/2-activating kinases. Combined deletion of MAP4Ks and MST1/2, but neither alone, suppresses phosphorylation of LATS1/2 and YAP/TAZ in response to a wide range of signals. Our results demonstrate that MAP4Ks act in parallel to and are partially redundant with MST1/2 in the regulation of LATS1/2 and YAP/TAZ, and establish MAP4Ks as components of the expanded Hippo pathway.

Heliconius butterfly wing pattern mimicry is driven by cis-regulatory variation of the optix gene.

Article10 May 2011free access Modulating F-actin organization induces organ growth by affecting the Hippo pathway Leticia Sansores-Garcia Leticia Sansores-Garcia Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA Search for more papers by this author Wouter Bossuyt Wouter Bossuyt Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA Search for more papers by this author Ken-Ichi Wada Ken-Ichi Wada Laboratory for Embryonic Induction, RIKEN Center for Developmental Biology, Hyogo, Japan Search for more papers by this author Shigenobu Yonemura Shigenobu Yonemura Electron Microscope Laboratory, RIKEN Center for Developmental Biology, Hyogo, Japan Search for more papers by this author Chunyao Tao Chunyao Tao Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA Search for more papers by this author Hiroshi Sasaki Hiroshi Sasaki Laboratory for Embryonic Induction, RIKEN Center for Developmental Biology, Hyogo, Japan Search for more papers by this author Georg Halder Corresponding Author Georg Halder Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA Program in Genes and Development, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA Search for more papers by this author Leticia Sansores-Garcia Leticia Sansores-Garcia Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA Search for more papers by this author Wouter Bossuyt Wouter Bossuyt Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA Search for more papers by this author Ken-Ichi Wada Ken-Ichi Wada Laboratory for Embryonic Induction, RIKEN Center for Developmental Biology, Hyogo, Japan Search for more papers by this author Shigenobu Yonemura Shigenobu Yonemura Electron Microscope Laboratory, RIKEN Center for Developmental Biology, Hyogo, Japan Search for more papers by this author Chunyao Tao Chunyao Tao Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA Search for more papers by this author Hiroshi Sasaki Hiroshi Sasaki Laboratory for Embryonic Induction, RIKEN Center for Developmental Biology, Hyogo, Japan Search for more papers by this author Georg Halder Corresponding Author Georg Halder Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA Program in Genes and Development, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA Search for more papers by this author Author Information Leticia Sansores-Garcia1,‡, Wouter Bossuyt1,‡, Ken-Ichi Wada2, Shigenobu Yonemura3, Chunyao Tao1, Hiroshi Sasaki2 and Georg Halder 1,4,5 1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA 2Laboratory for Embryonic Induction, RIKEN Center for Developmental Biology, Hyogo, Japan 3Electron Microscope Laboratory, RIKEN Center for Developmental Biology, Hyogo, Japan 4Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA 5Program in Genes and Development, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding author. Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, 1515 Holcombe Boulevard, S11.8316A, Houston, TX 77030, USA. Tel.: +1 713 834 6288; Fax: +1 713 834 6273; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2011)30:2325-2335https://doi.org/10.1038/emboj.2011.157 There is a Have you seen? (June 2011) associated with this Article. PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The Hippo tumour suppressor pathway is a conserved signalling pathway that controls organ size. The core of the Hpo pathway is a kinase cascade, which in Drosophila involves the Hpo and Warts kinases that negatively regulate the activity of the transcriptional coactivator Yorkie. Although several additional components of the Hippo pathway have been discovered, the inputs that regulate Hippo signalling are not fully understood. Here, we report that induction of extra F-actin formation, by loss of Capping proteins A or B, or caused by overexpression of an activated version of the formin Diaphanous, induced strong overgrowth in Drosophila imaginal discs through modulating the activity of the Hippo pathway. Importantly, loss of Capping proteins and Diaphanous overexpression did not significantly affect cell polarity and other signalling pathways, including Hedgehog and Decapentaplegic signalling. The interaction between F-actin and Hpo signalling is evolutionarily conserved, as the activity of the mammalian Yorkie-orthologue Yap is modulated by changes in F-actin. Thus, regulators of F-actin, and in particular Capping proteins, are essential for proper growth control by affecting Hippo signalling. Introduction The Hippo (Hpo) tumour suppressor pathway has emerged as a key signalling pathway that controls tissue size in Drosophila and vertebrates (Pan, 2010; Zhao et al, 2010; Halder and Johnson, 2011). Hpo signalling inhibits growth by suppressing cell proliferation and by promoting apoptosis. Thus, fruit flies that lack Hpo pathway activity in imaginal discs, the precursors of adult structures, have severely overgrown discs and corresponding adult structures. The Hpo pathway therefore regulates tissue size during development. However, signals that control the activity of the Hpo pathway are poorly understood (Pan, 2010; Zhao et al, 2010; Halder and Johnson, 2011). Several components of the Hpo pathway have been discovered and a signal transduction pathway from the plasma membrane into the nucleus has emerged (Pan, 2010; Zhao et al, 2010; Halder and Johnson, 2011). Central to the Hpo pathway is a kinase cascade involving the Hpo (Harvey et al, 2003; Jia et al, 2003; Pantalacci et al, 2003; Udan et al, 2003; Wu et al, 2003) and Warts (Wts) kinases (Justice et al, 1995; Xu et al, 1995) and their adaptor proteins Salvador (Sav) (Kango-Singh et al, 2002; Tapon et al, 2002) and Mob as tumour suppressor (Mats) (Lai et al, 2005). Active Hpo phosphorylates and activates Wts (Wu et al, 2003), which inhibits the activity of the transcriptional coactivator Yorkie (Yki) by phosphorylation, leading to 14-3-3 binding and cytoplasmic retention (Huang et al, 2005; Dong et al, 2007; Zhao et al, 2007; Oh and Irvine, 2008, 2009). When unphosphorylated, Yki translocates to the nucleus where it binds to transcription factors, such as Scalloped (Sd) or Homothorax, and induces the expression of target genes that drive cell proliferation and cell survival (Goulev et al, 2008; Wu et al, 2008; Zhang et al, 2008; Zhao et al, 2008; Peng et al, 2009). Thus when active, Hpo and Wts suppress cell proliferation by suppressing the activity of Yki. Several components are known that act upstream of Hpo and Wts (Pan, 2010; Zhao et al, 2010; Halder and Johnson, 2011) such as the atypical Cadherin Fat (Bennett and Harvey, 2006; Cho et al, 2006; Silva et al, 2006; Willecke et al, 2006; Tyler and Baker, 2007), which transduces signals from Dachsous (Ds), an atypical cadherin related to Fat, and Four-jointed (Fj), a Golgi-resident kinase that phosphorylates Fat and Ds (Cho and Irvine, 2004; Ishikawa et al, 2008; Rogulja et al, 2008; Willecke et al, 2008), and Crumbs (Crb), a transmembrane protein regulating apical–basal cell polarity in epithelial cells (Bazellieres et al, 2009; Chen et al, 2010; Grzeschik et al, 2010; Ling et al, 2010; Robinson et al, 2010). Fat signal transduction involves the FERM-domain adaptor protein Expanded (Ex), the atypical myosin Dachs (D), and the kinase Discs overgrown (Dco), although through poorly understood processes (Cho and Irvine, 2004; Bennett and Harvey, 2006; Cho et al, 2006; Hamaratoglu et al, 2006; Mao et al, 2006; Silva et al, 2006; Willecke et al, 2006; Feng and Irvine, 2007, 2009; Tyler and Baker, 2007; Sopko et al, 2009), while Crb regulates the activity of the Hpo pathway by directly recruiting Ex to the plasma membrane (Chen et al, 2010; Ling et al, 2010; Robinson et al, 2010). Although Fat, Crb, and other proteins have been identified as critical upstream regulators of the Hpo pathway, the regulation of the pathway is not fully understood (Pan, 2010; Zhao et al, 2010; Halder and Johnson, 2011). Here, we show that loss of function of Capping proteins A and B (Cpa and Cpb), which leads to inappropriate F-actin polymerization, induces phenotypes resembling those caused by inactivation of the Hpo pathway, namely overgrowth, excess cell proliferation, and the induction of Hpo pathway target genes. These effects depend on normal Yki levels, indicating that actin dynamics regulate the activity of the Hpo pathway. Results Actin modulators affect Yorkie activity in S2 cells In order to identify novel regulators of the Hpo pathway, we performed a genome-wide RNAi screen in S2 cells using a Yki-dependent luciferase assay (Huang et al, 2005). In this assay, Yki is fused to the DNA-binding domain of Gal4 (GDBD), which recruits Yki to the promoter of a UAS-luciferase reporter construct inducing luciferase expression. To activate the Hpo pathway, we coexpressed Ex, an upstream activator of the pathway that attenuates Yki activity in this assay (Hamaratoglu et al, 2006) (Figure 1A). As a secondary assay, we rescreened positive hits using a similar reporter assay that used a Scute–GDBD fusion protein instead of Yki-GDBD, which is not regulated by Hpo signalling but induces luciferase expression levels comparable to the Yki-GDBD construct (Supplementary Figure S1). A gene was considered a positive hit when the dsRNA increased the activity of the Yki- but not the Scute-dependent readout. In this screen, we identified the known Hpo pathway components Hpo, Ex, Wts, Kibra, Sav, and Mats as regulators of Yki activity (Supplementary Table S1). As potential novel regulators of Hpo signalling, we identified the actin regulators Cpa and Cpb, Capulet (Capt), Twinstar (Tsr), Actin5C (Act5C), and Actin87E (Act87E) (Figure 1A). To exclude possible effects of actin on the expression of the Yki-GBDB or the Renilla luciferase transfection control plasmids, which use an actin responsive actin promoter, we validated these hits using another assay that expressed Yki and Renilla luciferase under the control of a metallothionein gene promoter and measured the activity of Yki by measuring the amount of luciferase produced by a construct that drives firefly luciferase by multimerized Sd-binding sites (3xSd2-Luc) (Zhang et al, 2008). In this assay, dsRNAs targeting cpa, cpb, capt, and tsr tested positive as modifiers of Yki activity (Figure 1B). Notably, these four genes have in common that mutations in them lead to extra F-actin accumulation (Gunsalus et al, 1995; Benlali et al, 2000; Delalle et al, 2005; Janody and Treisman, 2006). In addition to these four genes, we identified Wasp and Arc-p20, which stimulate F-actin formation and for which the dsRNA inhibited Yki activity (Supplementary Table S1). To confirm that lowering F-actin levels reduce Yki activity, we treated S2 cells with the F-actin destabilizing drug, cytochalasin D. Using a construct expressing Yki and Renilla luciferase under control of the methallothionein promoter and using the 3xSd2-Luc reporter as a readout for Yki activity, we found that treatment of cells with cytochalasin D lead to the inhibition of Yki activity, but did not affect Renilla luciferase expression (Figure 1C and D). Together, these data show that changing F-actin levels modulates the activity of Yki in cultured Drosophila cells. We next wanted to test whether F-actin organization also affects the Hpo pathway in vivo. Figure 1.Actin modulators regulate Yorkie activity in vitro. Luciferase activity assays normalized with a Renilla luciferase control for transfection efficiency. (A) Drosophila S2 cells were transiently transfected with plasmids expressing UAS-Luciferase and Yki-GDBD alone or cotransfected with HA-Ex constructs in the presence of the dsRNAs as indicated. (B) Drosophila S2 cells were transiently transfected with the Yki-reporter construct 3xSd2-Luciferase and pMT-Yki in the presence of the dsRNAs as indicated. (C) Luciferase activity produced by pMT-Yki driving the 3xSd2-Luciferase reporter construct in vehicle (DMSO) and cytochalasin D (CytoD) treated S2 cells. (D) Renilla Luciferase activity produced by the transfection control plasmid is the same in vehicle (DMSO) and cytochalasin D (CytoD) treated S2 cells. The error bars represent ‘standard error of the mean’ (s.e.m.). Download figure Download PowerPoint Extra F-actin polymerization causes tissue overgrowth in vivo To analyse potential effects of F-actin on Hpo signalling in vivo, we expressed transgenic double-stranded RNAs to knockdown actin modulators during wing disc development. In addition, we artificially induced F-actin formation by overexpressing an activated version of the actin nucleation factor Diaphanous (DiaCA), which triggers extra F-actin polymerization (Somogyi and Rorth, 2004; Mulinari et al, 2008). We used three different Gal4 drivers: hh-Gal4, which expresses in the posterior compartment of wing discs, dpp-Gal4, which expresses along the anterior–posterior compartment boundary, and 30A-Gal4, which drives expression in the presumptive hinge region (Figure 2A–C). Figure 2.Induction of F-actin polymerization induces overgrowth of imaginal discs. (A–J) Confocal images of third instar wing imaginal discs showing (A) UAS-GFP expression driven by hh-Gal4, (B) UAS-GFP expression driven by dpp-Gal4, and (C) UAS-GFP expression driven by 30A-Gal4. (D) BrdU incorporation in a wild-type disc. (E) Phalloidin staining of hh-Gal4, UAS-GFP, UAS-cpaRNAi. (F) BrdU (red, grey in F′′) and GFP (green, grey in F′) staining of hh-Gal4, UAS-GFP, UAS-cpaRNAi. (G) Phalloidin staining of dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-diaCA. (H) BrdU (red, grey in H′′) and GFP (green, grey in H′) staining of dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-diaCA. (I) Phalloidin staining of 30A-Gal4, UAS-GFP, UAS-diaCA. (J) BrdU (red, grey in J′′) and GFP (green, grey in J′) staining of 30A-Gal4, UAS-GFP, UAS-diaCA. (K–M) Quantification of the size of the GFP expression domains normalized to the size of the entire imaginal disc of the indicated genotypes. *** indicates that the two populations are different with P<0.001. Note that Gal4 in the dpp- and 30A-Gal4 driver lines is not stably expressed in cell lineages but is lost when progenitor cells move away from the domain where Gal4 expression was induced. Therefore, non-GFP expressing cells may show upregulated BrdU due to earlier Gal4 expression driving DiaCA. Thus, seemingly non-autonomous effects may still be due to cell autonomous action of DiaCA. Similar effects may apply to analysis of the expression of ex-lacZ in Figure 3. Download figure Download PowerPoint Knockdown of cpa and cpb in vivo resulted in overgrowth phenotypes in wing discs (Figure 2E and F; Supplementary Figure S2), which was especially evident in the presumptive hinge region (Supplementary Figure S3). Similarly, overexpression of DiaCA lead to overgrowth (Figure 2G–J), which was even stronger than that caused by Cpa or Cpb knockdown. These overgrowths were characterized by increased F-actin accumulation as expected and extra folding of the imaginal discs (Figure 2E, G and I). We quantified the amount of overgrowth by measuring the relative size of the Gal4 expression domains and found that the knockdown of cpa or overexpression of DiaCA induced overgrowth ranging from 31% (hh-Gal4, UAS-cpaRNAi) to over 140% (dpp-Gal4, UAS-DiaCA) (Figure 2K–M). This overgrowth is characterized by an increase in proliferation as knockdown of cpa or overexpression of DiaCA elevated the levels of BrdU incorporation in the domain in which these transgenes were overexpressed (Figure 2D, F′′, H′′ and J′′). We conclude that the induction of ectopic F-actin formation by loss of Capping proteins or by activated Dia causes extra cell proliferation and overgrowth in imaginal discs. Thus, Cpa and Cpb act as tumour suppressors during wing disc development. Changes in actin organization affect Hippo pathway target gene expression The observed overgrowth and proliferation phenotypes prompted the question of whether these phenotypes were caused by the deregulation of the Hpo pathway, as the overgrowth phenotypes resembled those caused by loss of Hpo signalling. We thus analysed the expression of two Yki reporters, namely ex-lacZ, a lacZ enhancer trap insertion in the ex locus (Boedigheimer and Laughon, 1993) and diap1-GFP, a diap1 reporter transgene (Zhang et al, 2008). We found that both Yki reporters were upregulated upon the expression of cpaRNAi, cpbRNAi, or DiaCA (Figure 3A–D; Supplementary Figures S2 and S4). Importantly, we found that ex-lacZ, which is regulated by the Hpo pathway in various imaginal discs (Hamaratoglu et al, 2006), was upregulated in wing and leg discs in response to DiaCA overexpression (Figure 3C and D; Supplementary Figure S4). In addition, we analysed Wingless (Wg) expression, which is regulated by Hpo signalling in the presumptive wing hinge region (Cho and Irvine, 2004). Expression of both cpaRNAi and DiaCA caused ectopic Wg expression in the presumptive hinge (Figure 3E–H). These results show that loss of Capping proteins, or induction of F-actin polymerization by DiaCA, leads to strong upregulation of different Yki downstream genes, thus mimicking Wts loss of function (Supplementary Figure S4). This suggests that Capping proteins restrict growth by affecting the Hpo pathway. Figure 3.Actin modulators regulate Hippo pathway target genes. Confocal images of third instar wing imaginal discs. (A–D) GFP (green) and ex-lacZ (red, grey in A′–D′) staining of (A) hh-Gal4, UAS-GFP, (B) hh-Gal4, UAS-GFP, UAS-cpaRNAi, (C) 30A-Gal4, UAS-GFP, UAS-diaCA, and (D) dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-diaCA. (E–H) Wingless (Wg) antibody staining of (E) wild type, (F) hh-Gal4, UAS-GFP, UAS-cpaRNAi, (G) dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-diaCA, and (H) 30A-Gal4, UAS-GFP, UAS-diaCA. (I) Close-up image of a clone of cells in the wing pouch region of a wing disc expressing UAS-cpaRNAi, UAS-bskDN, and UAS-GFP driven by Flip-out-Gal4 stained for ex-lacZ (red, grey in I′) and Phalloidin (blue, grey in I′′′) and showing GFP expression (green, grey in I′′). Download figure Download PowerPoint To test whether the upregulation of Yki target genes was a cell autonomous response to elevated F-actin levels, we analysed ex-lacZ expression in clones of cells that had a knockdown of Cpa and coexpressed a dominant negative version of the Basket JNK (bskDN) to prevent JNK-mediated apoptosis, known to be induced in cpa mutant cells (Janody and Treisman, 2006). We found that ex-lacZ was upregulated cell autonomously in such mutant clones, including cells abutting the clone border, but not in cells outside the clones (Figure 3I). Control clones expressing bskDN alone did not effect ex-lacZ expression (Supplementary Figure S5). These results indicate that extra F-actin activates Yki cell autonomously. Notably, coexpression of bskDN with cpaRNAi either in Gal4 expressing clones (Supplementary Figure S5), or in the entire posterior compartment driven by hh-Gal4, caused upregulation of ex-lacZ expression (Supplementary Figure S5), indicating that the upregulation of Yki activity does not depend on JNK activity, although the overgrowth caused by cpaRNAi was partially suppressed by bskDN. Therefore, extra F-actin may regulate Yki activity in JNK-dependent, in addition to JNK-independent mechanisms. F-actin-induced overgrowth and upregulation of Hippo target genes requires Yorkie To investigate the interaction between actin organization and Hpo signalling, we first tested for dominant genetic interaction between overexpression of DiaCA and reduction of yki. In the developing eye, overexpression of DiaCA with gmr-Gal4 caused high mortality at the pupal stage (1% survival of expected frequency; Figure 4D), and the few survivors had severely compromised, amorphous eye structures (Figure 4A and B). Removal of one copy of yki in this background significantly rescued the eye phenotype and mortality (54% of expected ratio; Figure 4C and D). These data indicate that DiaCA-induced phenotypes are sensitive to Yki levels. Figure 4.Yorkie is required for actin dynamics induced overgrowth and upregulation of Hippo target genes. (A–C) Adult flies of the indicated genotypes. (D) Quantification of the number of enclosed adult flies of the genotypes in (B, C) relative to (A). (E) Confocal image of a third instar wing imaginal disc stained for GFP (green, grey in E′), Yki (red, grey in E′′), and Dapi (blue, grey in E′′′) of hh-Gal4, UAS-GFP, UAS-cpaRNAi. (F, I) Third instar wing imaginal discs stained for GFP (green) and ex-lacZ (red, grey in F′–I′) of (F) hh-Gal4, UAS-GFP, UAS-ykiRNAi, (G) hh-Gal4, UAS-GFP, UAS-ykiRNAi, UAS-cpaRNAi, (H) dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-ykiRNAi, and (I) dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-ykiRNAi, UAS-diaCA. Download figure Download PowerPoint Next, we tested whether F-actin affects Yki localization. We found that knockdown of cpa caused redistribution of Yki from a largely cytoplasmic localization to a more uniform distribution that included the nucleus (Figure 4E), similar to the phenotypes caused by wts and hpo mutations (Dong et al, 2007; Oh and Irvine, 2008). We then tested whether the upregulation of Hpo pathway reporters in response to increased F-actin accumulation requires Yki. As reported previously, expression of ykiRNAi leads to a decrease in ex-lacZ expression and reduced growth (Figure 4F and H) (Zhang et al, 2008). In contrast, expression of cpaRNAi or DiaCA leads to a strong increase in ex-lacZ and increased growth (Figure 3B–D). However, coexpression of ykiRNAi with cpaRNAi or DiaCA suppressed the upregulation of ex-lacZ and overgrowth caused by cpaRNAi or DiaCA expression (Figure 4G and I), while coexpression of an irrelevant wRNAi or adding a second UAS construct (UAS-GFP) had no effect (Supplementary Figure S6). In fact, the observed phenotypes were similar to those caused by expression of ykiRNAi alone, indicating that the effects of cpaRNAi or DiaCA expression depend on normal Yki levels. Similarly, knockdown of Yki reduced the upregulation of Wg in the hinge region caused by expression of cpaRNAi or DiaCA (Supplementary Figure S6). Altogether, these experiments show that Yki is required for the overgrowth and the induction of Hpo pathway target genes in response to conditions that stimulate F-actin formation. Modulation of Hippo signalling is a specific downstream effect of changes in actin organization The observation that increased F-actin polymerization caused overgrowth and deregulation of Hpo signalling is striking but raised the question of the specificity of this effect. Actin is required for many processes, for example for the localization of adherence junction components, an important step in the maintenance of epithelial cell polarity (Li and Gundersen, 2008). Loss of epithelial cell polarity can deregulate the Hpo pathway (Grzeschik et al, 2010; Menendez et al, 2010; Sun and Irvine, 2011) and cause excess proliferation (Dow and Humbert, 2007). We therefore analysed cell polarity upon the induction of ectopic F-actin formation. We investigated the localization of different markers for the apical (Crb and Patj) and baso-lateral (Dlg) membranes and adherens junction (Armadillo and E-cadherin) (Dow and Humbert, 2007). We did not find significant changes in their subcellular localization in the domain that had knockdown of Cpa (Supplementary Figure S7). Overexpression of DiaCA caused more excessive overgrowth and severe folding of the affected region, such as the presumptive hinge region in the 30A-Gal4 crosses. While some cells overexpressing DiaCA were extruded from the epithelium and showed piknotic nuclei, many remained in the epithelium and showed relatively normal localization of the polarity markers E-cadherin, Patj, Crb, and Dlg (Supplementary Figure S8). Therefore, the effects of actin dynamics on growth are unlikely due solely to defects in cell polarity. We next investigated whether increased F-actin deregulates other pathways involved in growth of imaginal discs. We assayed readouts for Hedgehog (Hh) and Decapentaplegic (Dpp) signalling, two major signalling pathways that operate during wing development (Neto-Silva et al, 2009). We assayed Cubitus interuptus whose levels indicate the activity of Hh signalling (Chen et al, 1999), and the phosphorylation status of Mad, which correlates with the activity of Dpp signalling (Teleman and Cohen, 2000). We found that patterns and levels of these two readouts were not significantly affected by cpaRNAi or DiaCA expression (Supplementary Figures S7 and S8). Altogether, we conclude that extra F-actin formation does not cause general defects in cell signalling and thus that the effects on Hpo signalling are a specific downstream effect of the loss of Capping proteins and DiaCA expression. Overexpression of Warts suppresses diaphanous-induced phenotypes To gain insight into how F-actin affects Hpo signalling, we first tested whether changes in actin organization affect the localization of Hpo pathway components. We tested the localization of Ex, Mer, and Hpo, none of which was significantly affected upon downregulation of Cpa, although Ex protein levels were upregulated (Supplementary Figure S9), mirroring the increase in ex-lacZ expression. We then set out to test at what level in the pathway DiaCA affects Hpo signalling. To do this, we used constructs overexpressing Ex, Hpo, and Wts which are able to activate Hpo signalling (Udan et al, 2003; Hamaratoglu et al, 2006), resulting in the downregulation of ex-lacZ (Figure 5A, C and E). Wts overexpression significantly suppressed the DiaCA-induced overgrowth (Figure 5E–G) and the induction of Hpo pathway target genes ex-lacZ (Figure 5E and F) and Wg (Supplementary Figure S10). Notably, Ex and Hpo overexpression had only limited effects on the DiaCA-induced phenotypes (Figure 5A–D and G; Supplementary Figure S10), although in wild type, overexpression of Ex and Hpo have stronger effects on growth than Wts overexpression (Supplementary Figure S10). Neither Wts, Ex, nor Hpo overexpression significantly suppressed the accumulation of F-actin caused by DiaCA overexpression (Supplementary Figure S11). These data suggest that F-actin affects the Hpo pathway upstream of Wts but in parallel to Ex and Hpo, although other possibilities cannot be excluded. Figure 5.Overexpression of Warts suppresses Diaphanous-induced phenotypes. Confocal images of ex-lacZ (red and grey A′–F′) and GFP (green) stainings of third instar wing imaginal discs of (A) dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-ex, (B) dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-ex, UAS-diaCA, (C) dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-hpo, (D) dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-hpo, UAS-diaCA, (E) dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-wts, and (F) dpp-Gal4, UAS-GFP, UAS-wts, UAS-diaCA. (G) Semi-quantification of the sizes of the expression domains of discs with the genotypes shown in this figure. Download figure Download PowerPoint Changes in actin organization affect Yap activity in mammalian cells The factors that regulate actin dynamics and the components that make up the Hpo pathway are highly conserved in vertebrates (Pan, 2010; Zhao et al, 2010; Halder and Johnson, 2011). We therefore tested whether the interaction between actin dynamics and Hpo signalling is also present in mammalian cells. First, we plated HeLa cells at high density and transfected them with a construct that expressed an activated mDia (mDiaCA) protein to induce extra F-actin polymerization (Watanabe et al, 1999; Copeland and Treisman, 2002) and quantified nuclear localization of Yap, a mammalian orthologue of Yki. The expression of mDiaCA lead to a significant increase in the number of cells exhibiting nuclear Yap (46% increase; Figure 6A, B and E), indicating that Hpo signalling was compromised in these cells. Next, we tested whether the disruption of F-actin in HeLa cells by cytochalasin D (Prentki et al, 1979) causes the inverse effect, namely a reduction of nuclear Yap localization. Indeed, 1 h after cytochalasin D treatment, the number of cells with nuclear Yap localization was decreased 2.1-fold (Figure 6C, D and F). Since the localization of Yap affects its activity, we next assayed the transcriptional activity of Yap. Yap induces expression of target genes by binding to TEAD transcription factors (Vassilev et al, 2001; Ota and Sasaki, 2008; Zhao et al, 2008). Yap activity can thus be measured by comparing the activity of a TEAD-responsive reporter that contains TEAD-binding sites (8xGTIIc-d51) with a non-responsive reporter (d51) (Ota and Sasaki, 2008). Under control conditions, the TEAD-responsive reporter had a two-fold higher expression than the non-responsive reporter (Figure 6G). When F-actin polymerization was increased by overexpression of mDiaCA, the activity of the TEAD-re

Abstract Transcriptional reprogramming of proliferative melanoma cells into a phenotypically distinct invasive cell subpopulation is a critical event at the origin of metastatic spreading. Here we generate transcriptome, open chromatin and histone modification maps of melanoma cultures; and integrate this data with existing transcriptome and DNA methylation profiles from tumour biopsies to gain insight into the mechanisms underlying this key reprogramming event. This shows thousands of genomic regulatory regions underlying the proliferative and invasive states, identifying SOX10/MITF and AP-1/TEAD as regulators, respectively. Knockdown of TEADs shows a previously unrecognized role in the invasive gene network and establishes a causative link between these transcription factors, cell invasion and sensitivity to MAPK inhibitors. Using regulatory landscapes and in silico analysis, we show that transcriptional reprogramming underlies the distinct cellular states present in melanoma. Furthermore, it reveals an essential role for the TEADs, linking it to clinically relevant mechanisms such as invasion and resistance.

ABSTRACT The Drosophila Pax-6 gene eyeless acts high up in the genetic hierarchy involved in compound eye development and can direct the formation of extra eyes in ectopic locations. Here we identify sine oculis and eyes absent as two mediators of the eye-inducing activity of eyeless. We show that eyeless induces and requires the expression of both genes independently during extra eye development. During normal eye development, eyeless is expressed earlier than and is required for the expression of sine oculis and eyes absent, but not vice versa. Based on the results presented here and those of others, we propose a model in which eyeless induces the initial expression of both sine oculis and eyes absent in the eye disc. sine oculis and eyes absent then appear to participate in a positive feedback loop that regulates the expression of all three genes. In contrast to the regulatory interactions that occur in the developing eye disc, we also show that in the embryonic head, sine oculis acts in parallel to eyeless and twin of eyeless, a second Pax-6 gene from Drosophila. Recent studies in vertebrate systems indicate that the epistatic relationships among the corresponding vertebrate homologs are very similar to those observed in Drosophila.