The largely unused uracil-excision molecular cloning technique has excellent features in most aspects compared to other modern cloning techniques. Its application has, however, been hampered by incompatibility with proof-reading DNA polymerases. We have advanced the technique by identifying PfuCx as a compatible proof-reading DNA polymerase and by developing an improved vector design strategy. The original features of the technique, namely simplicity, speed, high efficiency and low cost are thus combined with high fidelity as well as a transparent, simple and flexible vector design. A comprehensive set of vectors has been constructed covering a wide range of different applications and their functionality has been confirmed.

Gibberellins (GAs) are plant hormones that promote a wide range of developmental processes. While GA signalling is well understood, little is known about how GA is transported or how GA distribution is regulated. Here we utilize fluorescently labelled GAs (GA-Fl) to screen for Arabidopsis mutants deficient in GA transport. We show that the NPF3 transporter efficiently transports GA across cell membranes in vitro and GA-Fl in vivo. NPF3 is expressed in root endodermis and repressed by GA. NPF3 is targeted to the plasma membrane and subject to rapid BFA-dependent recycling. We show that abscisic acid (ABA), an antagonist of GA, is also transported by NPF3 in vitro. ABA promotes NPF3 expression and GA-Fl uptake in plants. On the basis of these results, we propose that GA distribution and activity in Arabidopsis is partly regulated by NPF3 acting as an influx carrier and that GA-ABA interaction may occur at the level of transport.

Abstract Bioengineering aimed at producing complex and valuable plant specialized metabolites in microbial hosts requires efficient uptake of precursor molecules and export of final products to alleviate toxicity and feedback inhibition. Plant genomes encode a vast repository of transporters of specialized metabolites that— due to lack of molecular knowledge—remains largely unexplored in bioengineering. Using phlorizin as a case study—an anti-diabetic and anti-cancerous flavonoid from apple—we demonstrate that brute-force functional screening of plant transporter libraries in Xenopus oocytes is a viable approach to identify transporters for bioengineering. By screening 600 Arabidopsis transporters, we identified and characterized pu rine p ermease 8 (AtPUP8) as a bidirectional phlorizin transporter. Functional expression in the plasma membrane of a phlorizin-producing yeast strain increased phlorizin titer by more than 80 %. This study provides a generic approach for identifying plant exporters of specialized metabolites and demonstrates the potential of transport-engineering for improving yield in bioengineering approaches.

Abstract Many herbivorous insects selectively accumulate plant toxins for defense against predators; however, little is known about the transport processes that enable insects to absorb and store defense compounds in the body. Here, we investigate how a specialist herbivore, the horseradish flea beetle, accumulates high amounts of glucosinolate defense compounds in the hemolymph. Using phylogenetic analyses of coleopteran membrane transporters of the major facilitator superfamily, we identified a clade of glucosinolate-specific transporters ( Pa GTRs) belonging to the sugar porter family. PaGTR expression was predominantly detected in the excretory system, the Malpighian tubules. Silencing of PaGTR s led to elevated glucosinolate excretion, significantly reducing the levels of sequestered glucosinolates in beetles. This suggests that Pa GTRs reabsorb glucosinolates from the Malpighian tubule lumen to prevent their loss by excretion. Ramsay assays performed with dissected Malpighian tubules confirmed a selective retention of glucosinolates. Thus, the selective accumulation of plant defense compounds in herbivorous insects can depend on the ability to prevent excretion.

Summary Lupins are promising protein crops that accumulate toxic quinolizidine alkaloids (QAs) in the seeds, complicating their end‐use. QAs are synthesized in green organs (leaves, stems, and pods) and a subset of them is transported to the seeds during fruit development. The exact sites of biosynthesis and accumulation remain unknown; however, mesophyll cells have been proposed as sources, and epidermal cells as sinks. We investigated the exact sites of QA biosynthesis and accumulation in biosynthetic organs of narrow‐leafed lupin ( Lupinus angustifolius ) using mass spectrometry‐based imaging (MSI), laser‐capture microdissection coupled to RNA‐Seq, and precursor feeding studies coupled to LC‐MS and MSI. We found that the QAs that accumulate in seeds (‘core’ QAs) were evenly distributed across tissues; however, their esterified versions accumulated primarily in the epidermis. Surprisingly, RNA‐Seq revealed strong biosynthetic gene expression in the epidermis, which was confirmed in leaves by quantitative real‐time polymerase chain reaction. Finally, feeding studies using a stably labeled precursor showed that the lower leaf epidermis is highly biosynthetic. Our results indicate that the epidermis is a major site of QA biosynthesis in narrow‐leafed lupin, challenging the current assumptions. Our work has direct implications for the elucidation of the QA biosynthesis pathway and the long‐distance transport network from source to seed.

Abstract Plants depend on transport processes for correct allocation of specialized metabolites. This is important for optimal defense, avoidance of autotoxicity, connecting compartmented biosynthetic modules and more. Transport of a wide variety of specialized metabolites is mediated by transporters from the Nitrate and Peptide transporter Family (NPF), which belongs to the Major Facilitator Superfamily (MFS). However, the mechanism by which NPF members recognize and transport specialized metabolites remains unknown. Here we mutate eight residues to reciprocally swap the substrate-preference of two closely related glucosinolate transporters (GTRs). Seven of these residues assemble in a ring-like structure in all conformations of the transporters. We labeled the ring-like structure a selectivity filter and based on docking studies, we propose that the interaction between the selectivity filter and the glucosinolate side chain determines whether a given glucosinolate is recognized as a substrate. Besides partly explaining the distinct substrate preference of GTR1 (NPF2.10) and GTR3 (NPF2.9), this study proposes fundamental principles of substrate recognition in the NPF and establishes the GTR subclade as a novel model system for studying structure function relationships in the NPF.

Summary Lupins are promising legume crops that accumulate toxic alkaloids in the seeds, complicating their use as high-protein crops. The alkaloids are synthesized in green organs (leaves, stems, and pods) and a subset of them is transported to the seeds during fruit development. The exact sites of biosynthesis and accumulation remain unknown, however mesophyll cells have been proposed as sources, and epidermal cells have been suggested as sinks. We examined the spatial localization of the alkaloids in biosynthetic organs of narrow-leafed lupin using mass spectrometry-based imaging (MSI). The alkaloids that accumulate in seeds (“core” alkaloids) were evenly distributed across tissues, however their esterified versions accumulated primarily in the epidermis. In addition, we generated a tissue-specific RNAseq dataset of biosynthetic organs using laser-capture microdissection. The dataset revealed that alkaloid biosynthetic genes are strongly expressed in the epidermis. To confirm the biosynthetic capacity of the leaf epidermis, we combined precursor feeding studies with mass spectrometry imaging, which showed that the lower epidermis is highly biosynthetic. Our work challenges the current assumptions on the precise sites of lupin alkaloid biosynthesis, with direct implications for the elucidation of the alkaloid biosynthesis pathway and the long-distance transport network from source to seed.

Based on recent in vitro data, a relatively large number of the plant Nitrate transporter 1/Peptide transporter Family (NPF) proteins has been suggested to function as gibberellic acid (GA) transporters. Most GA transporting NPF proteins also appear to transport other structurally unrelated phytohormones or metabolites. Several of the GAs used in previous in vitro assays are membrane permeable weak organic acids whose movement across membranes are influenced by the pH-sensitive ion-trap mechanism. Moreover, a large proportion of in vitro GA transport activities have been demonstrated indirectly via long-term yeast-based GA-dependent growth assays that are limited to detecting transport of bioactive GAs. Thus, there is a need for an optimized transport assay for identifying and characterizing GA transport. Here, we develop an improved transport assay in Xenopus laevis oocytes wherein we directly measure movement of six different GAs across oocyte membranes over short time. We show that membrane permeability of GAs in oocytes can be predicted based on number of oxygen atoms and that several GAs do not diffuse over membranes regardless of changes in pH values. In addition, we show that small changes in internal cellular pH can result in strongly altered distribution of membrane permeable phytohormones. This prompts caution when interpreting heterologous transport activities. We use our transport assay to screen all Arabidopsis thaliana NPF proteins for transport activity towards six GAs (two membrane permeable and four non-permeable). The results presented here, significantly reduce the number of bona fide NPF GA transporters in Arabidopsis and narrow the activity to fewer subclades within the family. Furthermore, to gain first insight into the molecular determinants of substrate specificities towards organic molecules transported in the NPF, we charted all surface exposed amino acid residues in the substrate-binding cavity and correlated them to GA transport. This analysis identified distinct residues within the substrate-binding cavity that are shared between GA transporting NPF proteins; the potential roles of these residues in determining substrate specificity are discussed.