Abstract Pulmonary arterial hypertension (PAH) remains an incurable and often fatal disease despite currently available therapies. Multiomics systems biology analysis can shed new light on PAH pathobiology and inform translational research efforts. Using RNA sequencing on the largest PAH lung biobank to date (96 disease and 52 control), we aim to identify gene co-expression network modules associated with PAH and potential therapeutic targets. Co-expression network analysis was performed to identify modules of co-expressed genes which were then assessed for and prioritized by importance in PAH, regulatory role, and therapeutic potential via integration with clinicopathologic data, human genome-wide association studies (GWAS) of PAH, lung Bayesian regulatory networks, single-cell RNA-sequencing data, and pharmacotranscriptomic profiles. We identified a co-expression module of 266 genes, called the pink module, which may be a response to the underlying disease process to counteract disease progression in PAH. This module was associated not only with PAH severity such as increased PVR and intimal thickness, but also with compensated PAH such as lower number of hospitalizations, WHO functional class and NT-proBNP. GWAS integration demonstrated the pink module is enriched for PAH-associated genetic variation in multiple cohorts. Regulatory network analysis revealed that BMPR2 regulates the main target of FDA-approved riociguat, GUCY1A2, in the pink module. Analysis of pathway enrichment and pink hub genes (i.e. ANTXR1 and SFRP4) suggests the pink module inhibits Wnt signaling and epithelial-mesenchymal transition. Cell type deconvolution showed the pink module correlates with higher vascular cell fractions (i.e. myofibroblasts). A pharmacotranscriptomic screen discovered ubiquitin-specific peptidases (USPs) as potential therapeutic targets to mimic the pink module signature. Our multiomics integrative study uncovered a novel gene subnetwork associated with clinicopathologic severity, genetic risk, specific vascular cell types, and new therapeutic targets in PAH. Future studies are warranted to investigate the role and therapeutic potential of the pink module and targeting USPs in PAH.

BACKGROUND: Integrative multiomics can elucidate pulmonary arterial hypertension (PAH) pathobiology, but procuring human PAH lung samples is rare. METHODS: We leveraged transcriptomic profiling and deep phenotyping of the largest multicenter PAH lung biobank to date (96 disease and 52 control) by integration with clinicopathologic data, genome-wide association studies, Bayesian regulatory networks, single-cell transcriptomics, and pharmacotranscriptomics. RESULTS: We identified 2 potentially protective gene network modules associated with vascular cells, and we validated ASPN , coding for asporin, as a key hub gene that is upregulated as a compensatory response to counteract PAH. We found that asporin is upregulated in lungs and plasma of multiple independent PAH cohorts and correlates with reduced PAH severity. We show that asporin inhibits proliferation and transforming growth factor–β/phosphorylated SMAD2/3 signaling in pulmonary artery smooth muscle cells from PAH lungs. We demonstrate in Sugen-hypoxia rats that ASPN knockdown exacerbated PAH and recombinant asporin attenuated PAH. CONCLUSIONS: Our integrative systems biology approach to dissect the PAH lung transcriptome uncovered asporin as a novel protective target with therapeutic potential in PAH.

Abstract Rationale The identification and role of endothelial progenitor cells (EPCs) in pulmonary arterial hypertension (PAH) remains controversial. Single-cell omics analysis can shed light on EPCs and their potential contribution to PAH pathobiology. Objectives We aim to identify EPCs in rat lungs and assess their relevance to preclinical and human PAH. Methods Differential expression, gene set enrichment, cell-cell communication, and trajectory reconstruction analyses were performed on lung endothelial cells from single-cell RNA-seq of Sugen-hypoxia, monocrotaline, and control rats. Relevance to human PAH was assessed in multiple independent blood and lung transcriptomic datasets. Measurements and Main Results A subpopulation of endothelial cells (EA2) marked by Tm4sf1 , a gene strongly implicated in cancer, harbored a distinct transcriptomic signature including Bmpr2 downregulation that was enriched for pathways such as inflammation and angiogenesis. Cell-to-cell communication networks specific to EA2 were activated in PAH such as CXCL12 signaling. Trajectory analysis demonstrated EA2 has a stem/progenitor cell phenotype. Analysis of independent datasets revealed Tm4sf1 is a marker for hematopoietic stem cells and is upregulated in PAH peripheral blood, particularly in patients with worse WHO functional class. EA2 signature genes including Procr and Sulf1 were found to be differentially regulated in the lungs of PAH patients and in PAH models in vitro , such as BMPR2 knockdown. Conclusions Our study uncovered a novel Tm4sf1 -marked stem/progenitor subpopulation of rat lung endothelial cells and demonstrated its relevance to preclinical and human PAH. Future experimental studies are warranted to further elucidate the pathogenic role and therapeutic potential of targeting EA2 and Tm4sf1 in PAH.

Introduction: Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a complex cardiopulmonary disease characterized by progressive vascular remodeling. Although various immune and vascular cell populations have been implicated in the pathobiology of PAH, a comprehensive assessment of the various cell types in human PAH lungs is still lacking. Methods: Single-nucleus RNA sequencing was performed on lung samples from the Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative using the 10x Genomics Chromium Fixed RNA Profiling workflow. Rigorous quality control measures were implemented, including the detection and removal of ambient RNA using CellBender and doublets using scDblFinder. Data normalization and dimensionality reduction were performed using Seurat, and alignment by sample and sequencing batch was conducted using Harmony. Cells were annotated by mapping onto the Human Lung Cell Atlas using Azimuth. Differential gene expression analysis was conducted using a robust pseudobulk approach with edgeR to limit false positive findings. Gene set enrichment analysis was performed using the Hallmark pathways. Results: Lung samples from a total of 67 individuals were profiled, including 42 PAH and 25 age- and sex-matched control lungs. After quality control filtering, over 800,000 cells were captured, with a median of 12,000 cells per sample. Clustering uncovered over 30 cell types, representing endothelial, stromal, immune, and epithelial lineages of the lung. A median of 2,500 transcripts and 1,500 genes were detected per cell. Differentially expressed genes between PAH and control were detected in all major cell populations (FDR < 0.05). Comparative analysis across all cell types revealed interferon response in monocyte subpopulations and endothelial-to-mesenchymal transition in endothelial subpopulations as top upregulated pathways. Conclusion: Comprehensive single-nucleus profiling of human lungs in PAH revealed extensive gene and pathway dysregulation across diverse cell types. This rich dataset provides a valuable resource for the research community, offering opportunities to advance and refine our understanding of the cellular pathobiology of PAH.