Genotype-by-sequencing has been proposed as an alternative to SNP genotyping arrays in genomic selection to obtain a high density of markers along the genome. It requires a low sequencing depth to be cost effective, which may increase the error at the genotype assigment. Third generation Nanopore sequencing technology offers low cost sequencing and the possibility to detect genome methylation, which provides added value to genotype-by-sequencing. The aim of this study was to evaluate the performance of genotype-by-LowPass Nanopore sequencing for estimating the direct genomic value in dairy cattle, and the possibility to obtain methylation marks simultaneously. Latest Nanopore chemistry (LSK14 and Q20) achieved a modal base calling accuracy of 99.55 %, whereas previous kit (LSK109) achieved slightly lower accuracy (99.1 %). The direct genomic value accuracy from genotype-by-Low Pass sequencing ranged between 0.79 and 0.99, depending on the trait, with a sequencing depth as low as 2x and using the latest chemistry (LSK114). Lower sequencing depth led to biased estimates, yet with high rank correlations. The LSK109 and Q20 achieved lower accuracies (0.57-0.93). More than one million high reliable methylated sites were obtained, even at low sequencing depth, located mainly in distal intergenic (87 %) and promoter (5 %) regions. This study showed that the latest Nanopore technology can be use in a LowPass sequencing framework to estimate direct genomic values with high reliability. It may provided advantages in populations with no available SNP chip, or when a large density of markers with a wide range of allele frequencies is needed. In addition, Low Pass sequencing provided with nucleotide methylation status of >1 million nucleotides at ≥ 10x, which is an added value for epigenetic studies.

During cancer evolution, tumor cells attract and dynamically interact with monocytes/macrophages. To find biomarkers of disease progression in human melanoma, we used unbiased RNA sequencing and secretome analyses of tumor and macrophage cocultures. Pathway analysis of genes differentially modulated in human macrophages exposed to melanoma cells revealed a general upregulation of inflammatory hallmark gene sets, particularly chemokines. A selective group of chemokines, including CCL20, CCL15 and CCL8, was actively secreted upon melanoma-macrophage coculture. Because we previously described the role of CCL20 in melanoma, we focused our study in CCL8 and CCL15, and confirmed that in vitro both chemokines contributed to melanoma survival, proliferation and 3D invasion, through CCR1 signaling. In vivo, both chemokines enhanced primary tumor growth, spontaneous lung metastasis and circulating tumor cell (CTC) survival and lung colonization in mouse xenograft models. Finally, we explored the clinical significance of CCL8 and CCL15 expression in human skin melanoma, screening a collection of 67 primary melanoma samples, by multicolor staining and quantitative image analysis of chemokine and chemokine receptor content at the single cell level. Primary skin melanomas displayed high CCR1 expression, but there was no difference in its level of expression between metastatic and non-metastatic cases. By contrast, the comparative analysis between these two clinically divergent groups showed a highly significant difference in the cancer cell content of CCL8 (P= 0.025) and CCL15 (P< 0.0001). Kaplan Meier curves showed that high content of CCL8 or CCL15 in cancer cells correlated with shorter disease free and overall survival (log rank test, p< 0.001). Our results highlight the role of CCL8 and CCL15, which are highly induced by melanoma-macrophage interactions in biologically aggressive primary melanomas, and could be clinically applicable biomarkers for patient profiling.

SUMMARY Monocyte-derived macrophages recruited into inflamed tissues can acquire an array of functional states depending on the extracellular environment. Since the anti-inflammatory/pro-fibrotic macrophage profile is determined by MAFB, whose activity/protein levels are regulated by GSK3, we addressed the macrophage re-programming potential of GSK3 modulation. GM-CSF-dependent (GM-MØ) and M-CSF-dependent monocyte-derived macrophages (M-MØ) exhibited distinct levels of inactive GSK3, and inhibiting GSK3 in GM-MØ led to acquisition of transcriptional, phenotypic and functional properties characteristic of M-MØ (enhanced expression of IL-10 and monocyte-recruiting factors, and higher efferocytosis). These re-programming effects were also observed upon GSK3α/β knockdown, and through GSK3 inhibition in ex vivo isolated human alveolar macrophages (AMØ). Notably, GSK3 downmodulation potentiated the transcriptional signature of Interstitial Macrophages (IMØ) while suppressed the AMØ-specific gene profile. Indeed, heightened levels of inactive GSK3 and MAFB-dependent proteins were observed in severe COVID-19 patients lung macrophages, highlighting the GSK3-MAFB axis as a therapeutic target for macrophage re-programming.