Neutrophils are the first line of defense at the site of an infection. They encounter and kill microbes intracellularly upon phagocytosis or extracellularly by degranulation of antimicrobial proteins and the release of Neutrophil Extracellular Traps (NETs). NETs were shown to ensnare and kill microbes. However, their complete protein composition and the antimicrobial mechanism are not well understood. Using a proteomic approach, we identified 24 NET-associated proteins. Quantitative analysis of these proteins and high resolution electron microscopy showed that NETs consist of modified nucleosomes and a stringent selection of other proteins. In contrast to previous results, we found several NET proteins that are cytoplasmic in unstimulated neutrophils. We demonstrated that of those proteins, the antimicrobial heterodimer calprotectin is released in NETs as the major antifungal component. Absence of calprotectin in NETs resulted in complete loss of antifungal activity in vitro. Analysis of three different Candida albicans in vivo infection models indicated that NET formation is a hitherto unrecognized route of calprotectin release. By comparing wild-type and calprotectin-deficient animals we found that calprotectin is crucial for the clearance of infection. Taken together, the present investigations confirmed the antifungal activity of calprotectin in vitro and, moreover, demonstrated that it contributes to effective host defense against C. albicans in vivo. We showed for the first time that a proportion of calprotectin is bound to NETs in vitro and in vivo.

Neutrophils phagocytose and kill microbes upon phagolysosomal fusion. Recently we found that activated neutrophils form extracellular fibres that consist of granule proteins and chromatin. These neutrophil extracellular traps (NETs) degrade virulence factors and kill Gram positive and negative bacteria. Here we show for the first time that Candida albicans, a eukaryotic pathogen, induces NET-formation and is susceptible to NET-mediated killing. C. albicans is the predominant aetiologic agent of fungal infections in humans, particularly in immunocompromised hosts. One major virulence trait of C. albicans is its ability to reversibly switch from singular budding cells to filamentous hyphae. We demonstrate that NETs kill both yeast-form and hyphal cells, and that granule components mediate fungal killing. Taken together our data indicate that neutrophils trap and kill ascomycetous yeasts by forming NETs.

Abstract Candida albicans , the primary etiology of human mycoses, is well-adapted to catabolize proline to obtain energy to initiate morphological switching (yeast to hyphal) and for growth. We report that put1-/- and put2-/ - strains, carrying defective P roline UT ilization genes, display remarkable proline sensitivity with put2 -/- mutants being hypersensitive due to the accumulation of the toxic intermediate P5C, which inhibits mitochondrial respiration. The put1-/ - and put2-/- mutations attenuate virulence in Drosophila and murine candidemia models. Using intravital 2-photon microscopy and label-free non-linear imaging, we visualized the initial stages of C. albicans cells colonizing a kidney in real-time, directly deep in the tissue of a living mouse, and observed morphological switching of wildtype but not of put2-/- cells. Multiple members of the Candida species complex, including C. auris , are capable of using proline as a sole energy source. Our results indicate that a tailored proline metabolic network tuned to the mammalian host environment is a key feature of opportunistic fungal pathogens.

Peritonitis is a leading cause of severe sepsis in surgical intensive care units, as over 70% of patients diagnosed with peritonitis develop septic shock. A critical role of the immune system is to return to homeostasis after combating infection. S100A8/A9 (calprotectin) is an antimicrobial, pro-inflammatory protein complex often used as a biomarker for diagnosis of disease activities in many inflammatory disorders. Here we describe the role of S100A8/A9 on inflammatory collateral tissue damage (ICTD).We performed an in vivo Candida albicans disseminated peritonitis mouse model using WT and S100A9-deficient mice and stimulated primary macrophages with recombinant S100A8/A9 in the presence or absence of the compound paquinimod, a specific inhibitor of S100A9. In addition, the effects on ICTD and fungal clearance were investigated. S100A9-deficient mice developed less ICTD than wildtype mice. Restoration of S100A8/A9 in S100A9 knockout mice resulted in increased ICTD and fungal clearance comparable to wildtype levels. Treatment with paquinimod abolished ICTD.The data indicated that S100A8/A9 controls ICTD levels and host antimicrobial modulation at a systemic level during intra-abdominal candidiasis (IAC).### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract The cytolytic peptide toxin candidalysin is secreted by the invasive, hyphal form of the human fungal pathogen, Candida albicans . Candidalysin is essential for inducing host cell damage during mucosal and systemic C. albicans infections, resulting in neutrophil recruitment. Neutrophil influx to C. albicans -infected tissue is critical for limiting fungal growth and preventing the fungal dissemination. Here, we demonstrate that candidalysin secreted by hyphae promotes the stimulation of neutrophil extracellular traps (NETs), while synthetic candidalysin triggers a distinct mechanism for NET-like structures (NLS), which are more compact and less fibrous than canonical NETs. Candidalysin activates NADPH oxidase and calcium influx, with both processes contributing to morphological changes in neutrophils resulting in NLS formation. NLS are induced by leukotoxic hypercitrullination, which is governed by protein arginine deaminase 4 activation via calcium influx and initiation of intracellular signalling events. However, activation of signalling by candidalysin does not suffice to trigger downstream events essential for NET formation, as demonstrated by lack of lamin A/C phosphorylation, an event required for activation of cyclin-dependent kinases that are crucial for NET release. Interestingly, exposure to candidalysin does not immediately restrict the capability of neutrophils to produce reactive oxygen species (ROS), nor to phagocytose particles. Instead, candidalysin triggers ROS production, calcium influx and subsequent activation of downstream signalling that drive morphological alteration and the formation of NLS in a dose- and time-dependent manner. Notably, candidalysin-triggered NLS demonstrate anti- Candida activity, which is resistant to nuclease treatment and dependent on the deprivation of Zn 2+ . This study reveals that C. albicans hyphae releasing candidalysin concurrently trigger canonical NETs and NLS, which together form a fibrous sticky network that entangles C. albicans hyphae and inhibits their growth. Importantly, this explains discrepancies of previous studies demonstrating that neutrophil-derived extracellular chromatin structures triggered by C. albicans can be both dependent and independent of ROS. Our data also demonstrate that while candidalysin hampers neutrophil function, the toxin also increases the capability of neutrophils to entangle hyphae and to restrict their growth, reflecting the importance of human neutrophils in controlling the dissemination of C. albicans .