Abstract The Baltic countries harbor a diverse assemblage of alien amphipods of Ponto-Caspian origin. The composition of this fauna was shaped by three invasion waves: 1) pre-20 th century dispersals via watershed-connecting canals, 2) deliberate introductions in the 1960s, and 3) new dispersals during the last decade via shipping and pre-existing canals. Given this rich invasion history, we test whether genetic diversity (mitochondrial and nuclear) differs between the native and invaded ranges and between the deliberately introduced species and the ones that dispersed on their own. Our results show a significant decrease in mitochondrial but not nuclear genetic diversity in the invaded Baltic range. We also find that in the invaded range the introduced species exhibit a higher mitochondrial and nuclear genetic diversity than the species that dispersed on their own, while in the native range only the nuclear diversity is higher in introduced species. Mitochondrial diversity was more structured geographically in the native range and the dominant invasive haplotypes were detected in the native populations of all but one species, further highlighting the utility of this marker in tracing invasion sources. Our comparative approach provides important insight into the inter-range genetic diversity of Ponto-Caspian invaders, highlighting the role of introduction mode.

Biodiversity is under threat by the ongoing global change and especially freshwater ecosystems are under threat by intensified land use, water abstraction and other anthropogenic stressors. In order to monitor the impacts that stressors have on freshwater biodiversity, it is important to know the current state of ecosystems and species living in them. This is often hampered by lacking knowledge on species and genetic diversity due to the fact that many taxa are complexes of several morphologically cryptic species. Lacking knowledge on species identity and ecology can lead to wrong biodiversity and stream quality assessments and molecular tools can greatly help resolving this problem. Here, we studied larvae of the caddisfly family Sericostomatidae in the Montseny mountains on the Iberian Peninsula. We expected to find cryptic species and that species would not occur in syntopy due to different ecological niches. We sampled 44 stream sites and sequenced 247 larval specimens for the barcoding region of the mitochondrial cytochrome c oxidase gene. A modeling approach was used to assess the bioclimatic preferences of the found species. Two molecular groups were identified. One could be assigned to Schizopelex furcifera and one to Sericostoma spp. We did find both taxa in syntopy in >50% of sampling sites and could show that the taxa prefer similar bioclimatic conditions. A reexamination of larval specimens showed that Sericostoma and Schizopelex larvae could not be unambiguously identified to the genus level. Overall, our results show the importance of including molecular tools into biodiversity assessments in order to correctly identify the species diversity of a region and to prevent wrong assessment results.

Anthropogenic impacts like intensified land use and climate change are severe threats to freshwater biodiversity and effective biodiversity monitoring is therefore one of the most urgent tasks. This is however often hampered by the lack of knowledge regarding the number and ecology of species. Molecular tools have shown many freshwater taxa to comprise morphologically cryptic species, which often occur in sympatry on a small geographic scale. Here, we studied the freshwater snail Ancylus fluviatilis (MUELLER, 1774) species complex in the Iberian Montseny Mountains. We hypothesised 1) that several species of A. fluviatilis sensu lato occur in the Montseny, 2) that different Ancylus species seldom co-occur in syntopy due to different ecological demands or interspecific competition, and 3) that species show a pattern of strong population structure within streams or catchments due to ecological preferences or local adaptation. We barcoded 180 specimens from 36 sites in the Montseny for the cytochrome c oxidase subunit I (COI) barcoding gene and molecularly identified two Ancylus species. These species seldom occurred in syntopy and a species distribution modelling approach showed differing bioclimatic preferences of the species. One species mainly occurs in cooler, higher altitude streams while the second species occurs in lower-altitude areas with higher temperatures. Tests of population structure showed that both species possibly do not disperse well in the study area and that populations within species are likely adapted to certain bioclimatic conditions in different regions of the Montseny. Our results highlight the need to incorporate molecular techniques into routine monitoring programmes.

DNA (meta)barcoding is used to study biodiversity and is available for standardised assessments. However, it suffers from PCR bias, which can lead to the loss of specific taxa. PCR-free techniques such as shotgun metagenomics are therefore thought to be more suited for biodiversity assessments, but are currently limited by incomplete reference libraries. The technique of "mitogenome-skimming" or "mitogenomics", in which complete mitochondrial genomes are sequenced, is ideal to bridge the techniques of (meta)barcoding and metagenomics. However, without the enrichment of mitochondria, roughly 99 % of all sequencing reads are of non-mitochondrial origin and mostly useless for common applications, e.g. species identification. Here, we present a simple centrifugation protocol that leads to an average 140-fold enrichment of mitochondrial DNA. By sequencing six "mock"- communities - comprising the freshwater taxa Corbicula fluminea, Gammarus roeselii and Hydropsyche exocellata each - we recovered whole mitochondrial genomes of these species and the acanthocephalan endoparasite Pomphorhynchus laevis. The presented protocol will greatly speed up building reference libraries for whole mitochondrial genomes, as dozens of species could be sequenced on a single MiSeq run. Subsequently, it will also allow biodiversity assessments using mitogenomics at greatly reduced costs in comparison to mitogenomic approaches without prior enrichment for mitochondria.

Environmental DNA metabarcoding has become a popular tool for the assessment of freshwater biodiversity, but it is largely unclear how sampling time and location influence the assessment of communities. Abiotic factors in rivers can change on small spatial and temporal scale and might greatly influence eDNA metabarcoding results. In this study, we sampled three German rivers at four locations per sampling site: 1. Left river side, surface water 2. Right river side, surface water, 3. Left side, close to the riverbed, 4. Right side, close to the riverbed. For the rivers Ruhr and Möhne, sampling was conducted three times in spring, each sampling one week apart. The Ruhr was again sampled in autumn and the Gillbach was sampled in winter. Sequencing on an Illumina MiSeq with COI primers Bf2/BR2 revealed diverse communities (6493 Operational taxonomic units, OTUs), which largely differed between rivers. Communities changed significantly over time in the Ruhr, but not in the Möhne. Sampling location influenced recovered communities in the Möhne and in the Ruhr in autumn. Our results have important implications for future eDNA studies, which should take into account that not all eDNA in rivers is everywhere, and not at all times.

Effective identification of species using short DNA fragments (DNA barcoding and DNA metabarcoding) requires reliable sequence reference libraries of known taxa. Both taxonomically comprehensive coverage and content quality are important for sufficient accuracy. For aquatic ecosystems in Europe, reliable barcode reference libraries are particularly important if molecular identification tools are to be implemented in biomonitoring and reports in the context of the EU Water Framework Directive (WFD) and the Marine Strategy Framework Directive (MSFD). We analysed gaps in the two most important reference databases, Barcode of Life Data Systems (BOLD) and NCBI GenBank, with a focus on the taxa most frequently used in WFD and MSFD. Our analyses show that coverage varies strongly among taxonomic groups, and among geographic regions. In general, groups that were actively targeted in barcode projects (e.g. fish, true bugs, caddisflies and vascular plants) are well represented in the barcode libraries, while others have fewer records (e.g. marine molluscs, ascidians, and freshwater diatoms). We also found that species monitored in several countries often are represented by barcodes in reference libraries, while species monitored in a single country frequently lack sequence records. A large proportion of species (up to 50%) in several taxonomic groups are only represented by private data in BOLD. Our results have implications for the future strategy to fill existing gaps in barcode libraries, especially if DNA metabarcoding is to be used in the monitoring of European aquatic biota under the WFD and MSFD. For example, missing species relevant to monitoring in multiple countries should be prioritized. We also discuss why a strategy for quality control and quality assurance of barcode reference libraries is needed and recommend future steps to ensure full utilization of metabarcoding in aquatic biomonitoring.

Abstract Sandy beaches are important ecosystems providing coastal protection and recreation, but they face significant threats from human activities and sea level rise. They are inhabited by meiofauna, small benthic invertebrates that are highly abundant and diverse, but are commonly understudied biotic components of beach ecosystems. Here, we investigate the factors shaping meiofaunal metacommunities by employing Generalised Dissimilarity Modelling (GDM) and Joint Species Distribution Modelling (JSDM) to study community turnover and assembly processes. We analysed over 550 meiofauna samples from a >650 km stretch of the southern North Sea coastline using a metabarcoding approach. Our findings reveal that environmental factors, especially Distance from Low Tide and Sediment Grain Size, are important drivers of meiofauna community turnover. This highlights the influence of the gradient from marine to terrestrial habitats and sediment conditions. Spatial factors, which indicate dispersal limitations, also significantly impact community composition, challenging the view that marine meiofauna have broad geographic distributions. The JSDM results show that species sorting by environmental conditions is the dominant process in community assembly with increasing environmental differences between sampling sites, but that biotic associations, or similar environmental preferences, are a major driver of community assembly at sites with similar environmental conditions. Further, we find that spatial factors also significantly influence community assembly across the study region. By facilitating the inference of ecological niches for a high number of meiofaunal taxa, JSDM provides a powerful framework for understanding the ecology of these animals. Our results highlight the importance of considering environmental gradients and dispersal limitations in meiofauna and beach ecosystem research, and future research should aim at adding information on functional traits and biotic interactions under varying environmental conditions to understand meiofauna community dynamics and resilience.

Abstract Aquatic macroinvertebrates are often identified based on morphology, but molecular approaches like DNA barcoding, metabarcoding and metagenomics are increasingly used for species identification. These approaches require the availability of DNA references deposited in public databases. Here we report the mitochondrial genomes of 11 aquatic macroinvertebrates species from Cyprus, a European Union island country in the Mediterranean. Only three of the molecularly identified species could be assigned to a species name, highlighting the need for taxonomic work that leads to the formal description and naming of species, and the need for further genetic work to fill the current gaps in reference databases containing aquatic macroinvertebrates. Graphical Abstract

Abstract European inland surface waters harbor an extensive diversity of native amphipod crustaceans with many species facing threats from invasive counterparts of Ponto-Caspian origin. Herein, we examine mitochondrial genomes to infer phylogenetic relationships and compare gene order and nucleotide composition between representative native European and invasive Ponto-Caspian taxa belonging to five families, ten genera, and 20 species (13 newly sequenced herein). We observe diverse gene rearrangement patterns in the phylogenetically disparate native species pool. Pallaseopsis quadrispinosa and Synurella ambulans show significant departures from the typical organization, with extensive translocations of tRNAs and the nad1 gene, as well as a tRNA-F polarity switch in the latter. The monophyletic alien Ponto-Caspian gammarids display a conserved gene order, mainly differing from the native species by a tRNA-E and tRNA-R translocation, which strengthens previous findings. However, extensive rearrangement is observed in Chaetogammarus warpachowskyi with translocations of six tRNAs. The alien corophiid, Chelicorophium curvispinum , displays a very conserved gene order despite its distant phylogenetic position. We also find that native species have a significantly higher GC and lower AT content than invasive ones. The observed mitogenomic differences between native and invasive amphipods need further investigation and could shed light on the mechanisms underlying invasion success.

Coral reefs are impacted worldwide by coastal eutrophication, which is often translated by a decrease in coral cover and an increase in potentially harmful invertebrates and algal blooms. Additionally to corals and other macro-benthos, micro-benthic communities are affected tremendously, however few studies reported the specific effect of eutrophication on those communities. This study addresses how micro-benthic communities are impacted by turbidity and associated eutrophication. To answer this question, we compared three groups that have been previously suggested as bioindicators of reef environmental conditions: foraminifera, diatoms and bacteria, from 12 islands (and 600 samples) in the Spermonde Archipelago (Indonesia) along a near- to offshore turbidity gradient. Insights from environmental DNA metabarcoding and satellite images highlighted differences between the reef slope (deep) and the reef flat (shallow) communities, a distinction that has been omitted in most previous studies. The reef flat communities were 1.5- to 2-fold more affected by turbidity parameters compared to the reef slope, which we argue is related to eutrophication. Based on previous work, we expected that prokaryotes would be the most impacted group by water quality. However, we found that large benthic foraminifera and diatom communities were highly impacted by turbidity, whereas the reef flat prokaryotic communities were primarily shaped by the substrate type. Additionally, a total of 112 exact sequence variants (ESVs) were identified as indicators of different turbidity levels, of which 87 foraminifera and diatom ESVs were associated with high-moderate turbid waters. Our study revealed fundamental knowledge and provides key information of the specific effect of turbidity and associated eutrophication and habitat variables (substrate type and reef area) on foraminifera, diatoms and prokaryotic communities. We argue that local and regional eutrophication participates in shaping reef flat micro-benthic communities, which may therefore play an important role as early warning signals for local degradation in coral reefs.