Abstract Summary:The program Fluctuation AnaLysis CalculatOR (FALCOR) is a web tool designed for use with Luria–Delbrück fluctuation analysis to calculate the frequency and rate from various mutation assays in bacteria and yeast. Three calculation methods are available through this program: (i) Ma-Sandri-Sarkar Maximum Likelihood Estimator (MSS-MLE) method, (ii) Lea-Coulson method of the median (LC) and (iii) frequency. Availability: The FALCOR rate calculator is currently accessible at http://www.mitochondria.org/protocols/FALCOR.html. This program is written as a Java™ Applet, requiring a web browser enabled with Sun MicroSystems' Java Virtual Machine. Contact: brandon.hall@roswellpark.org

Constitutive p16 Ink4a expression, along with senescence-associated β-galactosidase (SAβG), are commonly accepted biomarkers of senescent cells (SCs).Recent reports attributed improvement of the healthspan of aged mice following p16 Ink4a -positive cell killing to the eradication of accumulated SCs.However, detection of p16 Ink4a /SAβG-positive macrophages in the adipose tissue of old mice and in the peritoneal cavity of young animals following injection of alginate-encapsulated SCs has raised concerns about the exclusivity of these markers for SCs.Here we report that expression of p16 Ink4a and SAβG in macrophages is acquired as part of a physiological response to immune stimuli rather than through senescence, consistent with reports that p16 Ink4a plays a role in macrophage polarization and response.Unlike SCs, p16 Ink4a /SAβG-positive macrophages can be induced in p53-null mice.Macrophages, but not mesenchymal SCs, lose both markers in response to M1-[LPS, IFN-α, Poly(I:C)] and increase their expression in response to M2-inducing stimuli (IL-4, IL-13).Moreover, interferon-inducing agent Poly(I:C) dramatically reduced p16 Ink4a expression in vivo in our alginate bead model and in the adipose tissue of aged mice.These observations suggest that the antiaging effects following eradication of p16 Ink4a -positive cells may not be solely attributed to SCs but also to non-senescent p16 Ink4a /SAβG-positive macrophages.

Senescent cells (SCs) have been considered a source of age-related chronic sterile systemic inflammation and a target for anti-aging therapies. To understand mechanisms controlling the amount of SCs, we analyzed the phenomenon of rapid clearance of human senescent fibroblasts implanted into SCID mice, which can be overcome when SCs were embedded into alginate beads preventing them from immunocyte attack. To identify putative SC killers, we analyzed the content of cell populations in lavage and capsules formed around the SC-containing beads. One of the major cell types attracted by secretory factors of SCs was a subpopulation of macrophages characterized by p16(Ink4a) gene expression and β-galactosidase activity at pH6.0 (β-gal(pH6)), thus resembling SCs. Consistently, mice with p16(Ink4a) promoter-driven luciferase, developed bright luminescence of their peritoneal cavity within two weeks following implantation of SCs embedded in alginate beads. p16(Ink4a)/β-gal(pH6)-expressing cells had surface biomarkers of macrophages F4/80 and were sensitive to liposomal clodronate used for the selective killing of cells capable of phagocytosis. At the same time, clodronate failed to kill bona fide SCs generated in vitro by genotoxic stress. Old mice with elevated proportion of p16(Ink4a)/β-gal(pH6)-positive cells in their tissues demonstrated reduction of both following systemic clodronate treatment, indicating that a significant proportion of cells previously considered to be SCs are actually a subclass of macrophages. These observations point at a significant role of p16(Ink4a)/β-gal(pH6)-positive macrophages in aging, which previously was attributed solely to SCs. They require re-interpretation of the mechanisms underlying rejuvenating effects following eradication of p16(Ink4a)/β-gal(pH6)-positive cells and reconsideration of potential cellular target for anti-aging treatment.

Significance The accumulation of senescent cells over a lifetime causes age-related pathologies; however, the inability to reliably identify senescent cells in vivo has hindered clinical efforts to employ this knowledge as a means to ameliorate or reverse aging. Here, we describe a reporter allele, p16 tdTom , enabling the in vivo identification and isolation of cells featuring high-level activation of the p16 INK4a promoter. Our findings provide an insight into the functional and molecular characteristics of p16 INK4a -activated cells in vitro and in vivo. We show that such cells accumulate with aging or other models of injury, and that they exhibit clinically targetable features of cellular senescence.

Abstract LINE-1 (L1), the most abundant family of autonomous retrotransposons occupying over 17% of human DNA, is epigenetically silenced in normal tissues but frequently derepressed in cancer, suggesting that L1-encoded proteins may act as tumor-associated antigens recognized by the immune system. Here, we established an immunoassay for detecting circulating autoantibodies against L1 proteins in human blood. Using this assay in >3,000 individuals with or without cancer, we observed significantly higher IgG titers against L1-encoded ORF1p and ORF2p in patients with lung, pancreatic, ovarian, esophageal, and liver cancers compared to healthy individuals. Remarkably, elevated levels of anti-ORF1p-reactive IgG were observed in cancer patients with disease stages 1 and 2, indicating that immune response to L1 antigens can occur at early phases of carcinogenesis. We conclude that the antibody response against L1 antigens could contribute to the diagnosis and determination of immunoreactivity of tumors among cancer types that frequently escape early detection.