Cytochrome P450s form a large and diverse family of heme-containing proteins capable of carrying out many different enzymatic reactions. In both mammals and plants, some P450s are known to carry out reactions essential for processes such as hormone synthesis, while other P450s are involved in the detoxification of environmental compounds. In general, functions of insect P450s are less well understood. We characterized Drosophila melanogaster P450 expression patterns in embryos and 2 stages of third instar larvae. We identified numerous P450s expressed in the fat body, Malpighian (renal) tubules, and in distinct regions of the midgut, consistent with hypothesized roles in detoxification processes, and other P450s expressed in organs such as the gonads, corpora allata, oenocytes, hindgut, and brain. Combining expression pattern data with an RNA interference lethality screen of individual P450s, we identify candidate P450s essential for developmental processes and distinguish them from P450s with potential functions in detoxification.

Evolutionary changes in traits involved in both ecological divergence and mate choice may produce reproductive isolation and speciation. However, there are few examples of such dual traits, and the genetic and molecular bases of their evolution have not been identified. We show that methyl-branched cuticular hydrocarbons (mbCHCs) are a dual trait that affects both desiccation resistance and mate choice in Drosophila serrata. We identify a fatty acid synthase mFAS (CG3524) responsible for mbCHC production in Drosophila and find that expression of mFAS is undetectable in oenocytes (cells that produce CHCs) of a closely related, desiccation-sensitive species, D. birchii, due in part to multiple changes in cis-regulatory sequences of mFAS. We suggest that ecologically influenced changes in the production of mbCHCs have contributed to reproductive isolation between the two species.

ABSTRACT Metallothioneins (MTs) are a family of cysteine-rich metal-binding proteins that are important in the chelating and detoxification of toxic heavy metals. Until now, the short length and the low sequence complexity of MTs has hindered the possibility of any phylogenetic reconstruction, hampering the study of their evolution. To answer this longstanding question, we developed an iterative BLAST search pipeline that allowed us to build a unique dataset of more than 300 MT sequences in insects. By combining phylogenetics and synteny analysis, we reconstructed the evolutionary history of MTs in insects. We show that the MT content in insects has been shaped by lineage-specific tandem duplications from a single ancestral MT. Strikingly, we also uncovered a sixth MT, MtnF , in the model organism Drosophila melanogaster . MtnF evolves faster than other MTs and is characterized by a non-canonical length and higher cysteine content. Our methodological framework not only paves the way for future studies on heavy metal detoxification but also can allow us to identify other previously unidentified genes and other low complexity genomic features.

Abstract The vinegar fly Drosophila melanogaster is a pivotal model for invertebrate development, genetics, physiology, neuroscience, and disease. The whole family Drosophilidae, which contains over 4000 species, offers a plethora of cases for comparative and evolutionary studies. Despite a long history of phylogenetic inference, many relationships remain unresolved among the groups and genera in the Drosophilidae. To clarify these relationships, we first developed a set of new genomic markers and assembled a multilocus data set of 17 genes from 704 species of Drosophilidae. We then inferred well-supported group and species trees for this family. Additionally, we were able to determine the phylogenetic position of some previously unplaced species. These results establish a new framework for investigating the evolution of traits in fruit flies, as well as valuable resources for systematics.

ABSTRACT To survive in extreme environments such as hot-arid deserts, desert-dwelling species have evolved physiological traits to withstand the high temperatures and low aridity beyond the physiologically tolerable ranges of most species. Such traits which include reducing water loss have independently evolved in multiple taxa. However, the genetic and evolutionary mechanisms underlying these traits have thus far not been elucidated. Here we show that Drosophila mojavensis , a fruitfly species endemic to the Sonoran and Mojave deserts, had evolved extremely high desiccation resistance, by producing very long chained methylbranched cuticular hydrocarbons (mbCHCs) that contributes to a cuticular waterproofing lipid layer reducing water loss. We show that the ability to synthesize these longer mbCHCs is due to evolutionary changes in a fatty acyl-CoA elongase ( mElo ). CRISPR/Cas9 knockout of mElo in D. mojavensis led to loss of longer mbCHC production and significant reduction of desiccation resistance at high temperatures but did not affect mortality at high temperatures or desiccating conditions individually, indicating that this gene is crucial for desert adaptation. Phylogenetic analysis showed that mElo is a Drosophila specific gene with no clear ortholog outside Diptera. This suggests that while the physiological mechanisms underlying desert adaptation are general, the genetic mechanisms may be lineage-specific.

Abstract Maintaining water balance is a universal challenge for organisms living in terrestrial environments, especially for insects, which have essential roles in our ecosystem. Although the high surface area to volume ratio in insects makes them vulnerable to water loss, insects have evolved different levels of desiccation resistance to adapt to diverse environments. To withstand desiccation, insects use a lipid layer called cuticular hydrocarbons (CHCs) to reduce water evaporation from the body surface. It has long been hypothesized that the waterproofing capability of this CHC layer, which can confer different levels of desiccation resistance, depends on its chemical composition. However, it is unknown which CHC components are important contributors to desiccation resistance and how these components can determine differences in desiccation resistance. In this study, we used machine learning algorithms, correlation analyses, and synthetic CHCs to investigate how different CHC components affect desiccation resistance in 50 Drosophila and related species. We showed that desiccation resistance differences across these species can be largely explained by variation in cuticular hydrocarbons. In particular, length variation in a subset of CHCs, the methyl-branched CHCs (mbCHCs), is a key determinant of desiccation resistance. We also showed a significant correlation between the evolution of longer mbCHCs and higher desiccation resistance. Given the ubiquitous presence of mbCHCs in insects, the evolution of mbCHCs may be a general mechanism of how insects evolve desiccation resistance and adapt to diverse and changing environments. Significance As our planet is becoming more arid due to global warming, preventing dehydration is key to the survival of insects, an essential part of our ecosystem. However, factors that determine how insects may evolve resistance to desiccation are relatively unknown. Using Drosophila species from diverse habitats, we showed that variations in the composition of cuticular hydrocarbons (CHCs), a hydrophobic layer found on insects to prevent evaporative water loss, can largely explain desiccation resistance differences. In addition, the evolution of longer methyl-branched CHCs (mbCHCs), underlies the evolution of higher desiccation resistance in this genus. As mbCHCs are ubiquitously present in most insects, we suggest that evolutionary changes in mbCHCs may be a general determinant of desiccation resistance across insect species.

Abstract Well-controlled gene expression is critical for the proper development and function of many traits. Highly-specific temporal and spatial expression patterns are often due to the overlapping activities of activator and repressor sequences that form cis -regulatory elements called enhancers. While many studies have shown that evolutionary changes in enhancers can result in novel traits, few studies illuminate how enhancers originate, how activator and repressor sequences interact during enhancer evolution, and the order in which they evolve. Here, we traced the evolutionary origin of a recently evolved enhancer that drives the expression of the fatty acyl-CoA elongase, bond , specifically in the semicircular wall epithelium (swe) of the Drosophila male ejaculatory bulb (EB). We show that this enhancer consists of two activator regions that drive bond expression in the entire EB and a repressor region that restricts expression specifically to the EB swe. Interestingly, the repressor region preceded the evolution of the two activator regions. The evolution of the first activator region, consisting of two putative Abdominal-B sites, did not drive expression in the EB due to the action of the repressor region. Expression of bond in the EB swe requires the evolution of the second activator region, which does not drive expression on its own, but synergizes with the first activator region and the repressor region to produce a highly-specific spatial expression pattern. Our results show that the origin and evolution of a novel enhancer require multiple steps and the evolution of repressor sequences can precede the evolution of activator sequences.

Drosophila pigmentation has been a fruitful model system for understanding the genetic and developmental mechanisms underlying phenotypic evolution. For example, prior work has shown that divergence of the tan gene contributes to pigmentation differences between two members of the virilis group: Drosophila novamexicana, which has a light yellow body color, and D. americana, which has a dark brown body color. Quantitative trait locus (QTL) mapping and expression analysis has suggested that divergence of the ebony gene might also contribute to pigmentation differences between these two species. Here, we directly test this hypothesis by using CRISPR/Cas9 genome editing to generate ebony null mutants in D. americana and D. novamexicana and then using reciprocal hemizygosity testing to compare the effects of each species' ebony allele on pigmentation. We find that divergence of ebony does indeed contribute to the pigmentation divergence between species, with effects on both the overall body color as well as a difference in pigmentation along the dorsal abdominal midline. Motivated by recent work in D. melanogaster, we also used the ebony null mutants to test for effects of ebony on cuticular hydrocarbon (CHC) profiles. We found that ebony affects CHC abundance in both species, but does not contribute to qualitative differences in the CHC profiles between these two species. Additional transgenic resources for working with D. americana and D. novamexicana, such as white mutants of both species and yellow mutants in D. novamexicana, were generated in the course of this work and are also described. Taken together, this study advances our understanding of loci contributing to phenotypic divergence and illustrates how the latest genome editing tools can be used for functional testing in non-model species.

The birth-and-death evolutionary model proposes that some members of a multigene family are phylogenetically stable and persist as a single copy over time whereas other members are phylogenetically unstable and undergo frequent duplication and loss. Functional studies suggest that stable genes are likely to encode essential functions, while rapidly evolving genes reflect phenotypic differences in traits that diverge rapidly among species. One such class of rapidly diverging traits are insect cuticular hydrocarbons (CHCs), which play dual roles in chemical communications as short-range recognition pheromones as well as protecting the insect from desiccation. Insect CHCs diverge rapidly between related species leading to ecological adaptation and/or reproductive isolation. Because the CHC and essential fatty acid biosynthetic pathways share common genes, we hypothesized that genes involved in the synthesis of CHCs would be evolutionary unstable, while those involved in fatty acid-associated essential functions would be evolutionary stable. To test this hypothesis, we investigated the evolutionary history of the fatty acyl-CoA reductases (FARs) gene family that encodes enzymes in CHC synthesis. We compiled a unique dataset of 200 FAR proteins across 12 Drosophila species. We uncovered a broad diversity in FAR content which is generated by gene duplications, subsequent gene losses, and alternative splicing. We also show that FARs expressed in oenocytes and presumably involved in CHC synthesis are more unstable than FARs from other tissues. We suggest that a comparative approach investigating the birth-and-death evolution of gene families can identify candidate genes involved in rapidly diverging traits between species.

Abstract Understanding how endogenous and exogenous factors such as annual seasonal rhythm and photoperiodism affect the toxicity of pesticides can help design integrated pest management strategies. The two-spotted spider mite Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae), a worldwide phytophagous pest species distributed in areas with different time zones, is a good model to explore how the photoperiodism and seasonality affect the pesticide toxicity. In this study, we conducted a laboratory experiment from March 2017 to November 2018 where spider mites were reared at three photoperiod regimes in environmentally controlled incubators. The toxicities of two acaricides, propargite and diafenthiruon, were measured on T. urticae every month. To determine potential mechanisms underlying the changes in the acaricide toxicity, we measured body size and total GSTs activity with the toxicity measurements in 2018. Our results showed that the toxicities of the two acaricides were not significantly different among the three photoperiod regimes. However, both had a consistent trend along the season which increased in the spring and summer and decreased in the winter in all photoperiod regimes for two consecutive years, suggesting seasonality be an endogenous factor affecting the susceptibility of the spider mites to pesticide. Pearson’s correlation analyses showed only the body size had a weak negative correlation with the acaricide toxicities, suggesting a minor contribution to the higher toxicity from the smaller size of T. urticae . Our study is the first to show that seasonality can have an endogenous effect on the pesticide toxicity, and the results can inform practical insights into the pest management strategies.