Abstract The design of hydrogels as mimetics of tissues’ matrices typically disregards the viscous nature of native tissues and focuses only on their elastic properties. In the case of stem cell chondrogenesis, this has led to contradictory results, likely due to unreported changes of the matrices’ viscous modulus. Here, by employing isoelastic matrices with a Young’s modulus of ~12 kPa, we demonstrate that variations in viscous properties alone (i.e., loss tangent between 0.1-0.25) are sufficient to drive efficient growth factor-free chondrogenesis of human mesenchymal stem cells, both in 2D and 3D cultures. The increase of the viscous component of RGD-functionalised polyacrylamide or polyethylene glycol maleimide hydrogels promotes a phenotype with reduced adhesion, alters mechanosensitive signalling, and boosts cell-cell contacts. In turn, this upregulates the chondrogenic transcription factor SOX9 and supports neocartilage formation, demonstrating that the mechanotransductive response to the viscous nature of the matrix can be harnessed to direct cell fate.

Actomyosin contraction and relaxation in a monolayer is a fundamental biophysical process in development and homeostasis. Current methods used to characterize the mechanodynamics of monolayers often involve cells grown on solid supports such as glass or gels. The results of these studies are fundamentally influenced by these supporting structures. Here, we describe a new methodology for measuring the mechanodynamics of epithelial monolayers by culturing cells at an air-liquid interface. These model monolayers are grown in the absence of any supporting structures removing cell-substrate effects. This method's potential was evaluated by observing and quantifying the generation and release of internal stresses upon actomyosin contraction (320±50Pa) and relaxation (190±40Pa) in response to chemical treatments. Although unsupported monolayers exhibited clear major and minor strain axes, they were not correlated to nuclear alignment as observed when the monolayers were grown on soft deformable gels. It was also observed that both gels and glass substrates led to the promotion of long-range cell nuclei alignment not seen in the hanging drop model. This new approach provides us with a picture of basal actomyosin mechanodynamics in a simplified system allowing us to infer how the presence of a substrate impacts contractility and long-range multi-cellular organization and dynamics.

Although our understanding of cellular behavior in response to extracellular biological and mechanical stimuli has greatly advanced using conventional 2D cell culture methods, these techniques lack physiological relevance. We developed the microtissue vacuum-actuated stretcher (MVAS) to probe cellular behavior within a 3D multicellular environment composed of innate matrix protein, and in response to continuous uniaxial stretch. The MVAS consists of an array of fifty self-assembled microtissues bordered by vacuum chambers. When a vacuum is applied, the microtissues stretch in plane allowing live imaging. The MVAS is highly suitable for biomedical research and pharmaceutical discovery due to a high-throughput array format and scalable fabrication steps outlined in this paper. We validated our approach by characterizing the bulk microtissue strain, the microtissue strain field and single cell strain, and by assessing F-actin expression in response to chronic cyclic strain of 10%. The MVAS was shown to be capable of delivering reproducible dynamic bulk strain amplitudes up to 13% and the strain field had local maxima around each of the cantilevers. The strain at the single cell level was found to be 10.4% less than the microtissue axial strain due to cellular rotation. Chronic cyclic strain produced a 35% increase in F-actin expression consistent with previously observed cytoskeletal reinforcement in 2D cell culture. The MVAS may further our understanding of the reciprocity shared between cells and their environment, which is critical to meaningful biomedical research and successful therapeutic approaches.

Fibrosis is a leading cause of death in developed countries that is characterized by a progressive deterioration of tissue mechanical behavior. Developing methods to study tissue mechanics and myofibroblast activation may lead to new targets for therapeutic treatments that are urgently needed. Microtissue arrays are a promising approach to conduct relatively high throughput research into fibrosis as they recapitulate key biomechanical aspects of the disease through a relevant 3D extracellular environment. In early work, our group developed a device called the MVAS-force to stretch microtissues while enabling simultaneous assessment of their dynamic mechanical behavior. Here we investigated TGF-β1 induced fibroblast to myofibroblast differentiation in microtissue cultures using our MVAS-force device through assessing α-SMA expression, contractility and stiffness. By doing so, we linked cell-level phenotypic changes to functional changes that characterize the clinical manifestation of fibrotic disease. As expected, TGF-β1 treatment promoted a myofibroblastic phenotype and microtissues became stiffer and possessed increased contractility. Furthermore, these changes were partially reversible upon TGF-β1 withdrawal. In contrast, however, long-term cyclic stretching maintained myofibroblast activation. Furthermore stretching had no effect compared static cultures when TGF-β1 receptors were inhibited and stretching promoted myofibroblast differentiation when given latent TGF-β1. Together these results suggest that external mechanical stretch may activate latent TGF-β1 and might be a powerful stimulus for continued myofibroblast activation to progress fibrosis. Further exploration of this pathway with our approach may yield new insights into myofibroblast activation and more effective therapeutic treatments for fibrosis.

We report here a method of making polyketones from the coupling of diketones and diols using a manganese pincer complex. The methodology allows us to access various polyketones (polyarylalkylketone) containing aryl, alkyl, and ether functionalities, bridging the gap between the two classes of commercially available polyketones: aliphatic polyketones and polyaryletherketones. Using this methodology, 12 polyketones have been synthesized and characterized using various analytical techniques to understand their chemical, physical, morphological, and mechanical properties. Based on previous reports and our studies, we suggest that the polymerization occurs via a hydrogen-borrowing mechanism that involves the dehydrogenation of diols to dialdehyde followed by aldol condensation of dialdehyde with diketones to form chalcone derivatives and their subsequent hydrogenation to form polyarylalkylketones.

Collagen-based (COL) hydrogels could be a promising treatment option for injuries to the articular cartilage (AC) becuase of their similarity to AC native extra extracellular matrix. However, the high hydration of COL hydrogels poses challenges for AC's mechanical properties. To address this, we developed a hydrogel platform that incorporating cellulose nanocrystals (CNCs) within COL and followed by plastic compression (PC) procedure to expel the excessive fluid out. This approach significantly improved the mechanical properties of the hydrogels and enhanced the chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). Radially confined PC resulted in higher collagen fibrillar densities together with reducing fibril-fibril distances. Compressed hydrogels containing CNCs exhibited the highest compressive modulus and toughness. MSCs encapsulated in these hydrogels were initially affected by PC, but their viability improved after 7 days. Furthermore, the morphology of the cells and their secretion of glycosaminoglycans (GAGs) were positively influenced by the compressed COL-CNC hydrogel. Our findings shed light on the combined effects of PC and CNCs in improving the physical and mechanical properties of COL and their role in promoting chondrogenesis.

Abstract Characterizing the time-dependent mechanical properties of cells is not only necessary to determine how they deform, but also to fully understand how external forces trigger biochemical-signaling cascades to govern their behavior. Presently mechanical properties are largely assessed by applying local shear or compressive forces on single cells in isolation grown on non-physiological 2D surfaces. In comparison, we developed the microfabricated vacuum actuated stretcher to measure tensile loading of 3D multicellular ‘microtissue’ cultures. With this approach, we assessed here the time-dependent stress relaxation and recovery responses of microtissues, and quantified the spatial remodeling that follows step length changes. Unlike previous results, stress relaxation and recovery in microtissues measured over a range of step amplitudes and pharmacological treatments followed a stretched exponential behavior describing a broad distribution of inter-related timescales. Furthermore, despite a performed compendium of experiments, all responses led to a single linear relationship between the residual elasticity and degree of stress relaxation, suggesting that these mechanical properties are coupled through interactions between structural elements and the association of cells with their matrix. Lastly, although stress relaxation could be quantitatively and spatially linked to recovery, they differed greatly in their dynamics; while stress recovery behaved as a linear process, relaxation time constants changed with an inverse power law with step size. This assessment of microtissues offers insights into how the collective behavior of cells in a 3D collagen matrix generate the dynamic mechanical properties of tissues, which is necessary to understanding how cells deform and sense mechanical forces in the body.

When stretched, cells cultured on 2D substrates share a universal softening and fluidization response that arises from poorly understood remodeling of well-conserved cytoskeletal elements. It is known, however, that the structure and distribution of the cytoskeleton is profoundly influenced by the dimensionality of a cell’s environment. Therefore, in this study we aimed to determine whether cells cultured in a 3D matrix share this softening behavior and to link it to cytoskeletal remodeling. To achieve this, we developed a high-throughput approach to measure the dynamic mechanical properties of cells and allow for sub-cellular imaging within physiologically relevant 3D microtissues. We found that fibroblast, smooth muscle and skeletal muscle microtissues strain softened but did not fluidize, and upon loading cessation, they regained their initial mechanical properties. Furthermore, microtissue prestress decreased with the strain amplitude to maintain a constant mean tension. This adaptation under an auxotonic condition resulted in lengthening. A filamentous actin cytoskeleton was required, and responses were mirrored by changes to actin remodeling rates and visual evidence of stretch-induced actin depolymerization. Our new approach for assessing cell mechanics has linked behaviors seen in 2D cultures to a 3D matrix, and connected remodeling of the cytoskeleton to homeostatic mechanical regulation of tissues.