Abstract DEAD-box helicases, which are crucial for many aspects of RNA metabolism, often contain intrinsically disordered regions (IDRs), whose functions remain unclear. Using multiparameter confocal microscopy, we reveal that sex chromosome-encoded homologous RNA helicases, DDX3X and DDX3Y, form nano-sized RNA-protein clusters (RPCs) that foster their catalytic activities in vitro and in cells. The IDRs are critical for the formation of these RPCs. A thorough analysis of the catalytic cycle of DDX3X and DDX3Y by ensemble biochemistry and single molecule photon bursts in the confocal microscope showed that RNA release is a major step that differentiates the unwinding activities of DDX3X and DDX3Y. Our findings provide new insights that the nano-sized helicase RPCs may be the normal state of these helicases under non-stressed conditions that promote their RNA unwinding and act as nucleation points for liquid-liquid phase separation under stress. This mechanism may apply broadly among other members of the DEAD-box helicase family.

The balance between epithelial stemness and differentiation requires the precise regulation of gene expression programs. Epitranscriptomic RNA modifications have been implicated in both epithelial development as well as cancers. However, the underlying mechanisms are poorly understood. Here, we show that deletion of the m 6 A methyltransferase, METTL3, impairs the m 6 A-mediated degradation of numerous mRNA transcripts encoding critical chromatin modifying enzymes, resulting in widespread gene expression abnormalities as well as both aberrant cutaneous and oral epithelial phenotypes in vivo . Collectively, these results offer new insights into a new layer of gene regulation within epithelial surface tissues and will inform future epitranscriptomic studies within epithelial cancer and developmental biology.

Abstract Several rRNA modifying enzymes install rRNA modifications while participating in ribosome assembly. Here, we show that 18 S rRNA methyltransferase DIMT1 is essential for acute myeloid leukemia (AML) proliferation through a non-catalytic function. We reveal that targeting a positively charged cleft of DIMT1, remote from the catalytic site, weakens the binding of DIMT1 to rRNA and mis-localizes DIMT1 to the nucleoplasm, in contrast with the primarily nucleolar localization of wild-type DIMT1. Mechanistically, rRNA binding is required for DIMT1 to undergo liquid-liquid phase separation, which explains why the distinct nucleoplasm localization of the rRNA-binding deficient DIMT1. Re-expression of wild-type or a catalytically inactive mutant E85A, but not the rRNA-binding deficient DIMT1, supports AML cell proliferation. This study provides a new strategy to target DIMT1-regulated AML proliferation via targeting this essential non-catalytic region.

Abstract The sex chromosome-encoded RNA helicases DDX3X and DDX3Y play important roles in RNA metabolism. Heterozygous mutations of DDX3X frequently occur in cancers and neurodevelopmental disorders which have strong sex biases. However, how different DDX3X variants impair cellular function in sex specific genetic background is not understood. Herein, we found that DDX3X variants with significantly impaired ATPase activities demixed into the shells of unique hollow condensates, the dynamics of which were further differentiated by the RNA binding affinities of the different DDX3X variants. Proteomic and imaging studies revealed that DDX3X variant condensates sequestered wild-type DDX3X, DDX3Y, and other proteins important for various signaling pathways. Intriguingly, wild-type DDX3X improved the dynamics of heterogenous variant/wild-type hollow condensates more than DDX3Y. These results suggest that DDX3X variants with distinct enzymatic and condensation propensities may interact uniquely with wild-type DDX3X or DDX3Y to cause sex-specific cellular impacts.