SUMMARY RodZ of rod-shaped bacteria functions to link MreB filaments to the Rod peptidoglycan (PG) synthase complex that moves circumferentially perpendicular to the long cell axis, creating hoop-like sidewall PG. Ovoid-shaped bacteria, such as Streptococcus pneumoniae (pneumococcus; Spn ) that lack MreB, use a different modality for peripheral PG elongation that emanates from the midcell of dividing cells. Yet, S. pneumoniae encodes a RodZ homolog similar to RodZ in rod-shaped bacteria. We show here that the helix-turn-helix and transmembrane domains of RodZ( Spn ) are essential for growth at 37°C. Δ rodZ mutations are suppressed by Δ pbp1a , mpgA (Y488D), and Δ khpA mutations that suppress Δ mreC , but not Δ cozE . Consistent with a role in PG elongation, RodZ( Spn ) co-localizes with MreC and aPBP1a throughout the cell cycle and forms complexes and interacts with PG elongasome proteins and regulators. Depletion of RodZ( Spn ) results in aberrantly shaped, non-growing cells and mislocalization of elongasome proteins MreC, PBP2b, and RodA. Moreover, Tn-seq reveals that RodZ( Spn ), but not MreCD( Spn ), displays a specific synthetic-viable genetic relationship with aPBP1b, whose function is unknown. We conclude that RodZ( Spn ) acts as a scaffolding protein required for elongasome assembly and function and that aPBP1b, like aPBP1a, plays a role in elongasome regulation and possibly peripheral PG synthesis. Graphical Summary

ABSTRACT GpsB links peptidoglycan synthases to other proteins that determine the shape of the respiratory pathogen Streptococcus pneumoniae (pneumococcus; Spn ) and other low-GC Gram-positive bacteria. GpsB is also required for phosphorylation of proteins by the essential StkP( Spn ) Ser/Thr protein kinase. Here we report three classes of frequently arising chromosomal duplications (≈21-176 genes) containing murZ (MurZ-family homolog of MurA) or murA that suppress Δ gpsB or Δ stkP . These duplications arose from three different repeated sequences and demonstrate the facility of pneumococcus to modulate gene dosage of numerous genes. Overproduction of MurZ or MurA alone or overexpression of MurZ caused by Δ khpAB mutations suppressed Δ gpsB or Δ stkP phenotypes to varying extents. Δ gpsB and Δ stkP were also suppressed by MurZ amino-acid changes distant from the active site, including one in commonly studied laboratory strains, and by truncation or deletion of the homolog of IreB(ReoM). Unlike in other Gram-positive bacteria, MurZ is predominant to MurA in pneumococcal cells. However, Δ gpsB and Δ stkP were not suppressed by Δ clpCP , which did not alter MurZ or MurA amounts. These results support a model in which regulation of MurZ and MurA activity, likely by IreB( Spn ), is the only essential requirement for protein phosphorylation in exponentially growing D39 pneumococcal cells.