Human prostaglandin (PG) E synthase (EC 5.3.99.3 ) is a member of a recently recognized protein superfamily consisting of membrane associated proteins involved in eicosanoid and glutathione metabolism (the MAPEG family). Previous designations of the protein are PIG12 and MGST1-L1. PGE synthase was expressed in Escherichia coli , and both cytosolic and membrane fractions were prepared. Western blot analysis specifically detected a 15- to 16-kDa protein in the membrane fraction. Both fractions were incubated with prostaglandin H 2 in the presence or absence of reduced glutathione. The membrane but not the cytosolic fraction was found to possess high glutathione-dependent PGE synthase activity (0.25 μmol/min/mg). The human tissue distribution was analyzed by Northern blot analysis. High expression of PGE synthase mRNA was detected in A549 and HeLa cancer cell lines. Intermediate level of expression was demonstrated in placenta, prostate, testis, mammary gland, and bladder whereas low mRNA expression was observed in several other tissues. A549 cells have been used as a model system to study cyclooxygenase-2 induction by IL-1β. If A549 cells were grown in the presence of IL-1β, a significant induction of the PGE synthase was observed by Western blot analysis. Also, Western blot analysis specifically detected a 16-kDa protein in sheep seminal vesicles. In summary, we have identified a human membrane bound PGE synthase. The enzyme activity is glutathione-dependent, and the protein expression is induced by the proinflammatory cytokine IL-1β. PGE synthase is a potential novel target for drug development.

Autoimmunity is complicated by bone loss. In human rheumatoid arthritis (RA), the most severe inflammatory joint disease, autoantibodies against citrullinated proteins are among the strongest risk factors for bone destruction. We therefore hypothesized that these autoantibodies directly influence bone metabolism. Here, we found a strong and specific association between autoantibodies against citrullinated proteins and serum markers for osteoclast-mediated bone resorption in RA patients. Moreover, human osteoclasts expressed enzymes eliciting protein citrullination, and specific N-terminal citrullination of vimentin was induced during osteoclast differentiation. Affinity-purified human autoantibodies against mutated citrullinated vimentin (MCV) not only bound to osteoclast surfaces, but also led to robust induction of osteoclastogenesis and bone-resorptive activity. Adoptive transfer of purified human MCV autoantibodies into mice induced osteopenia and increased osteoclastogenesis. This effect was based on the inducible release of TNF-α from osteoclast precursors and the subsequent increase of osteoclast precursor cell numbers with enhanced expression of activation and growth factor receptors. Our data thus suggest that autoantibody formation in response to citrullinated vimentin directly induces bone loss, providing a link between the adaptive immune system and bone.

Prostaglandin (PG)E 2 is a potent mediator of pain and inflammation, and high levels of this lipid mediator are observed in numerous disease states. The inhibition of PGE 2 production to control pain and to treat diseases such as rheumatoid arthritis to date has depended on nonsteroidal antiinflammatory agents such as aspirin. However, these agents inhibit the synthesis of all prostanoids. To produce biologically active PGE 2 , PGE synthases catalyze the isomerization of PGH 2 into PGE 2 . Recently, several PGE synthases have been identified and cloned, but their role in inflammation is not clear. To study the physiological role of the individual PGE synthases, we have generated by targeted homologous recombination a mouse line deficient in microsomal PGE synthase 1 (mPGES1) on the inbred DBA/1lacJ background. mPGES1-deficient (mPGES1 -/- ) mice are viable and fertile and develop normally compared with wild-type controls. However, mPGES1 -/- mice displayed a marked reduction in inflammatory responses compared with mPGES1 +/+ mice in multiple assays. Here, we identify mPGES1 as the PGE synthase that contributes to the pathogenesis of collagen-induced arthritis, a disease model of human rheumatoid arthritis. We also show that mPGES1 is responsible for the production of PGE 2 that mediates acute pain during an inflammatory response. These findings suggest that mPGES1 provides a target for the treatment of inflammatory diseases and pain associated with inflammatory states.

Abstract Oligodendrocyte-lineage cells, including NG2 glia, undergo prominent changes in various neurodegenerative disorders. This raises the question of how myelinating cells interact with neurodegenerative processes. Here, we found that NG2 glia were activated after prion infection in cerebellar organotypic cultured slices (COCS) and in brains of prion-inoculated mice. In both model systems, depletion of NG2 glia exacerbated prion-induced neurodegeneration and accelerated prion pathology. Loss of NG2 glia unleashed a microglial reaction promoting the biosynthesis of prostaglandin E2 (PGE2), which augmented prion neurotoxicity in the HovS cell line, primary neurons and COCS through binding to the EP4 receptor. Single-cell RNA sequencing revealed molecular signatures of inflammatory, disease-associated and MHC + microglia but not of interferon-responsiveness in PGE2-producing microglia of prion-inoculated mice. Pharmacological or genetic inhibition of PGE2 biosynthesis attenuated prion-induced neurodegeneration in COCS and mice, reduced the enhanced neurodegeneration in NG2-glia-depleted COCS after prion infection, and dampened the acceleration of prion disease in NG2-glia-depleted mice. These data unveil a non-cell-autonomous interaction between NG2 glia and microglia in prion disease and suggest that PGE2 signaling may represent an actionable target against prion diseases.

We screened 57 chemical probes, high-quality tool compounds, and relevant clinically used drugs to investigate their effect on pro-inflammatory prostaglandin E2 (PGE2) production and interleukin-8 (IL-8) secretion in human whole blood. Freshly drawn blood from healthy volunteers and patients with systemic lupus erythematosus (SLE) or dermatomyositis was incubated with compounds at 0.1 or 1 μM and treated with lipopolysaccharide (LPS, 10 μg/mL) to induce a pro-inflammatory condition. Plasma was collected after 24 hours for lipid profiling using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and IL-8 quantification using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Each compound was tested in at least four donors at one concentration based on prior knowledge of binding affinities and in vitro activity. Our screening suggested that PD0325901 (MEK-1/2 inhibitor), trametinib (MEK-1/2 inhibitor), and selumetinib (MEK-1 inhibitor) decreased while tofacitinib (JAK inhibitor) increased PGE2 production. These findings were validated by concentration-response experiment in two donors. Moreover, the tested MEK inhibitors decreased thromboxane B2 (TXB2) production and IL-8 secretion. We also investigated the lysophophatidylcholine (LPC) profile in plasma from treated whole blood as these lipids are potentially important mediators in inflammation, and we did not observe any changes in LPC profiles. Collectively, we deployed a semi-high throughput and robust methodology to investigate anti-inflammatory properties of new chemical probes.

ABSTRACT Objectives Autoantibodies are thought to play a key role in the pathogenesis of idiopathic inflammatory myopathies (IIM). However, up to 40% of IIM patients, even those with clinical manifestations of anti-synthetase syndrome (ASSD), test seronegative to all known myositis-specific autoantibodies (MSAs). We hypothesized the existence of new potential autoantigens among human cytoplasmic aminoacyl tRNA synthetases (aaRS) in patients with IIM. Methods Plasma samples and clinical data from 217 patients with, 50 patients with ASSD, 165 without, and two with unknown ASSD status were included retrospectively, as well as serum from 156 age/sex-matched population controls. Samples were screened using a multiplex bead array assay for presence of autoantibodies against a panel of 118 recombinant protein variants, representing 33 myositis-related proteins, including all 19 cytoplasmic aaRS. Results We identified reactivity towards 16 aaRS in 72 of the 217 patients. Twelve patients displayed reactivity against nine novel aaRS. The novel autoantibody specificities were detected in four patients previously seronegative for MSAs and in eight with previously detected MSAs. We also confirmed reactivity to four of the most common aaRS (Jo1, PL12, PL7, and EJ (n=45)) and identified patients positive for anti-Zo, -KS, and -HA (n=10) that were not previously tested. A low frequency of anti-aaRS autoantibodies was detected in controls. Conclusion Our results suggest that most, if not all, cytoplasmic aaRS may become autoantigenic. Autoantibodies against new aaRS may be found in plasma of patients previously classified as seronegative with potential high clinical relevance.

B-cell secretion of autoantibodies drives autoimmune diseases, including systemic lupus erythematosus and idiopathic inflammatory myositis. Few therapies are presently available for treatment of these patients, often resulting in unsatisfactory effects and helping only some of patients. We developed a screening assay for evaluation of novel targets suspending B-cell maturation into antibody secreting cells, which could contribute to future drug development. The assay was employed for testing 43 high quality chemical probes and compounds inhibiting under-explored protein targets, using primary cells from patients with autoimmune disease. Probes inhibiting bromodomain family proteins and histone methyl transferases demonstrated abrogation of B-cell functions to a degree comparable to a positive control, the JAK inhibitor tofacitinib. Inhibition of each target rendered a specific functional cell and potential disease modifying effect, indicating specific epigenetic protein targets as potential new intervention points for future drug discovery and development efforts.* ANCA : anti-neutrophil cytoplasmic antibody APRIL : A proliferation-inducing ligand Bach2 : BTB and CNC homologue 2 BAFF : B-cell activating factor Bcl6 : B-cell lymphoma 6 BET : bromodomains and extraterminal domain Blimp1 : B lymphocyte-induced maturation protein 1 CAR : chimeric antigen receptor DPBS : Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline EZH2 : enhancer or zeste homolog 2 Ig : Immunoglobulins IIM : idiopathic inflammatory myositis PBMCs : peripheral blood mononuclear cells PRC2 : polycomb repressive complex 2 SLE : systemic lupus erythematosus TLR : toll like receptor WDR5 : WD40-repeat protein 5

Oligodendrocyte-lineage cells, including NG2 glia, undergo prominent changes in various neurodegenerative disorders. Here, we identify a neuroprotective role for NG2 glia against prion toxicity. NG2 glia were activated after prion infection in cerebellar organotypic cultured slices (COCS) and in brains of prion-inoculated mice. In both model systems, depletion of NG2 glia exacerbated prion-induced neurodegeneration and accelerated prion pathology. Loss of NG2 glia enhanced the biosynthesis of prostaglandin E2 (PGE2) by microglia, which augmented prion neurotoxicity through binding to the EP4 receptor. Pharmacological or genetic inhibition of PGE2 biosynthesis attenuated prion-induced neurodegeneration in COCS and mice, reduced the enhanced neurodegeneration in NG2-glia-depleted COCS after prion infection, and dampened the acceleration of prion disease in NG2-glia-depleted mice. These data unveil a non-cell-autonomous interaction between NG2 glia and microglia in prion disease and suggest that PGE2 signaling may represent an actionable target against prion diseases.