Abstract The modification of flowering plant DNA by CHH methylation acts primarily to silence transposable elements, of which many active copies are present in Arabidopsis thaliana . During embryogenesis, the CHH methylation landscape is dramatically reprogrammed, resulting in exceedingly high levels of this modification upon mature embryo formation. The mechanisms constituting the remodeling process, and its function in embryos, are unclear. Here, we isolate embryos from Arabidopsis plants harboring mutations for key components of the pathways that confer CHH methylation, namely RNA-directed DNA methylation (RdDM) and the Chromomethylase 2 (CMT2) pathways. We reveal that embryos are more methylated than leaves at shared CMT2 and RdDM targeting loci, accounting for most embryonic CHH hypermethylation. While the majority of embryo CHH methylated loci overlap with those in somatic tissues, a subset of conventional pericentric CMT2-methylated loci are instead targeted by RdDM in embryos. These loci, termed ‘embRdDM’ exhibit intermediate H3K9me2 levels, associated with increased chromatin accessibility. Strikingly, more than 50% of the embRdDM loci in pollen vegetative (nurse) cells and ddm1 mutant somatic tissues are also targeted by RdDM, and these tissues were also reported to exhibit increased chromatin accessibility in pericentric heterochromatin. Furthermore, the root columella stem cell niche also displays CHH hypermethylation and an enriched presence of small RNAs at embRdDM loci. Finally, we observe a significant overlap of CHH hypermethylated loci with endosperm DEMETER targeting sites, suggesting that non-cell autonomous communication within the seed may contribute to the epigenetic landscape of the embryo. However, similar overlap with vegetative cell DEMETER targets indicates that the chromatin landscape that allows DEMETER access is mirrored in developing embryos, permitting CHH methylation catalysis at the same loci. Our findings demonstrate that both conserved and embryo-specific epigenetic mechanisms reshape CHH methylation profiles in the dynamic chromatin environment of embryogenesis.

The DEMETER (DME) DNA glycosylase catalyzes genome-wide DNA demethylation and is required for endosperm genomic imprinting and embryo viability. Targets of DME-mediated DNA demethylation reside in small, euchromatic, AT-rich transposons and at the boundaries of large transposons, but how DME interacts with these diverse chromatin states is unknown. The STRUCTURE SPECIFIC RECOGNITION PROTEIN 1 (SSRP1), subunit of the chromatin remodeler FAcilitates Chromatin Transactions (FACT), was previously shown to be involved in the DME-dependent regulation of genomic imprinting in Arabidopsis endosperm. Therefore, to investigate the interaction between DME and chromatin, we focused on the activity of the two FACT subunits, SSRP1 and SUPPRESSOR of TY16 (SPT16), during reproduction in Arabidopsis. We find that FACT co-localizes with nuclear DME in vivo, and that DME has two classes of target sites, the first being euchromatic and accessible to DME, but the second, representing over half of DME targets, requiring the action of FACT for DME-mediated DNA demethylation genome-wide. Our results show that the FACT-dependent DME targets are GC-rich heterochromatin domains with high nucleosome occupancy enriched with H3K9me2 and H3K27me1. Further, we demonstrate that heterochromatin-associated linker histone H1 specifically mediates the requirement for FACT at a subset of DME-target loci. Overall, our results demonstrate that FACT is required for DME targeting by facilitating its access to heterochromatin.

Abstract H2A.X is an H2A variant histone in eukaryotes, unique for its ability to respond to DNA damage, initiating the DNA repair pathway. H2A.X replacement within the histone octamer is mediated by the FAcilitates Chromatin Transactions (FACT) complex, a key chromatin remodeler. FACT is required for DEMETER (DME)-mediated DNA demethylation at certain loci in Arabidopsis thaliana female gametophytes during reproduction, though it is not known how FACT targets DME sites. Here, we investigated whether H2AX is involved in DME- and FACT-mediated DNA demethylation during Arabidopsis reproduction. We show that h2a.x mutants are more sensitive to genotoxic stress, consistent with previous reports. H2A.X fused to the Green Fluorescent Protein (GFP) gene under the H2A.X promoter was highly expressed in newly developing Arabidopsis tissues, including in male and female gametophytes. We examined DNA methylation in h2a.x developing seeds using whole genome bisulfite sequencing, and found that CG DNA methylation in the developing endosperm, but not the embryo, is decreased genome-wide in h2a.x mutants, predominately in transposons and intergenic DNA. Hypomethylated sites overlapped 62 % with canonical DME loci. These data indicate that H2A.X is not required for DME function, but is important for DNA methylation homeostasis in the unique chromatin environment of Arabidopsis endosperm.