Abstract Accurate antibiotic susceptibility testing is essential for successful tuberculosis treatment. Recent studies have highlighted the limitations of minimum inhibitory concentrations (MIC) based phenotypic susceptibility methods in detecting other aspects of antibiotic susceptibilities in bacteria. Duration and peak of antibiotic exposure, at or above the MIC required for killing the bacterial population, has emerged as another important factor for determining the antibiotic susceptibility. This is broadly defined as antibiotic tolerance. Antibiotic tolerance can further facilitate the emergence of antibiotic resistance. Currently there are limited methods to quantify antibiotic tolerance among clinical M. tuberculosis isolates. In this study, we develop a most-probable number (MPN) based minimum duration of killing (MDK) assay to quantify the spectrum of M. tuberculosis rifampicin susceptibility within subpopulations, based on time duration of rifampicin exposure required for killing the bacterial population. MDK 90 - 99 and MDK 99.99 defined as the minimum time duration of antibiotic exposure at or above MIC required for killing 90-99% and 99.99% of the initial (pre-treatment) bacterial population respectively. Results from the rifampicin MDK assay applied to 28 laboratory and clinical M. tuberculosis isolates showed that there is variation in rifampicin susceptibility among isolates. Rifampicin MDK 99 / 99.99 time for isolates varied from less than 2 to 10 days. MDK duration was correlated with larger sub-populations of M. tuberculosis from clinical isolates that were rifampicin tolerant. Our study demonstrates the utility of MDK assays to measure the variation in antibiotic tolerance among clinical M. tuberculosis isolates and further expands clinically important aspects of antibiotic susceptibility testing.

Abstract Background Combatting the tuberculosis (TB) epidemic caused by Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) necessitates a better understanding of the factors contributing to patient clinical outcomes and transmission. While host and environmental factors have been evaluated, the impact of Mtb genetic background and phenotypic diversity is underexplored. Previous work has made associations between Mtb genetic lineages and some clinical and epidemiological features, but the bacterial traits underlying these connections are largely unknown. Methods We developed a high-throughput functional genomics platform for defining genotype-phenotype relationships across a panel of Mtb clinical isolates. These phenotypic fitness profiles function as intermediate traits which can be linked to Mtb genetic variants and associated with clinical and epidemiological outcomes. We applied this approach to a collection of 158 Mtb strains from a study of Mtb transmission in Ho Chi Minh City, Vietnam. Mtb strains were genetically tagged in multiplicate, which allowed us to pool the strains and assess in vitro competitive fitness using deep sequencing across a set of 14 host-relevant antibiotic and metabolic conditions. Phylogenetic and monogenic associations with these intermediate traits were identified and then associated with clinical outcomes. Findings Mtb clinical strains have a broad range of growth and drug response dynamics that can be clustered by their phylogenetic relationships. We identified novel monogenic associations with Mtb fitness in various metabolic and antibiotic conditions. Among these, we find that mutations in Rv1339 , a phosphodiesterase, which were identified through their association with slow growth in glycerol, are further associated with treatment failure. We also identify a previously uncharacterized subclade of Lineage 1 strains (L1.1.1.1) that is phenotypically distinguished by slow growth under most antibiotic and metabolic stress conditions in vitro . This clade is associated with cavitary disease, treatment failure, and demonstrates increased transmission potential. Interpretation High-throughput phenogenotyping of Mtb clinical strains enabled bacterial intermediate trait identification that can provide a mechanistic link between Mtb genetic variation and patient clinical outcomes. Mtb strains associated with cavitary disease, treatment failure, and transmission potential display intermediate phenotypes distinguished by slow growth under various antibiotic and metabolic conditions. These data suggest that Mtb growth regulation is an adaptive advantage for host bacterial success in human populations, in at least some circumstances. These data further suggest markers for the underlying bacterial processes that govern these clinical outcomes. Funding National Institutes of Allergy and Infectious Diseases: P01 AI132130 (SS, SMF); P01 AI143575 (XW, SMF); U19 AI142793 (QL, SMF); 5T32AI132120-03 (SS); 5T32AI132120-04 (SS); 5T32AI049928-17 (SS) Wellcome Trust Fellowship in Public Health and Tropical Medicine: 097124/Z/11/Z (NTTT) National Health and Medical Research Council (NHMRC)/A*STAR joint call: APP1056689 (SJD) The funding sources had no involvement in study methodology, data collection, analysis, and interpretation nor in the writing or submission of the manuscript. Research in context Evidence before this study We used different combinations of the words mycobacterium tuberculosis, tuberculosis, clinical strains, intermediate phenotypes, genetic barcoding, phenogenomics, cavitary disease, treatment failure, and transmission to search the PubMed database for all studies published up until January 20 th , 2022. We only considered English language publications, which biases our search. Previous work linking Mtb determinants to clinical or epidemiological data has made associations between bacterial lineage, or less frequently, genetic polymorphisms to in vitro or in vivo models of pathogenesis, transmission, and clinical outcomes such as cavitary disease, treatment failure, delayed culture conversion, and severity. Many of these studies focus on the global pandemic Lineage 2 and Lineage 4 Mtb strains due in part to a deletion in a polyketide synthase implicated in host-pathogen interactions. There are a number of Mtb GWAS studies that have led to novel genetic determinants of in vitro drug resistance and tolerance. Previous Mtb GWAS analyses with clinical outcomes did not experimentally test any predicted phenotypes of the clinical strains. Published laboratory-based studies of Mtb clinical strains involve relatively small numbers of strains, do not identify the genetic basis of relevant phenotypes, or link findings to the corresponding clinical outcomes. There are two recent studies of other pathogens that describe phenogenomic analyses. One study of 331 M. abscessus clinical strains performed one-by-one phenotyping to identify bacterial features associated with clearance of infection and another details a competition experiment utilizing three barcoded Plasmodium falciparum clinical isolates to assay antimalarial fitness and resistance. Added value of this study We developed a functional genomics platform to perform high-throughput phenotyping of Mtb clinical strains. We then used these phenotypes as intermediate traits to identify novel bacterial genetic features associated with clinical outcomes. We leveraged this platform with a sample of 158 Mtb clinical strains from a cross sectional study of Mtb transmission in Ho Chi Minh City, Vietnam. To enable high-throughput phenotyping of large numbers of Mtb clinical isolates, we applied a DNA barcoding approach that has not been previously utilized for the high-throughput analysis of Mtb clinical strains. This approach allowed us to perform pooled competitive fitness assays, tracking strain fitness using deep sequencing. We measured the replicative fitness of the clinical strains in multiplicate under 14 metabolic and antibiotic stress condition. To our knowledge, this is the largest phenotypic screen of Mtb clinical isolates to date. We performed bacterial GWAS to delineate the Mtb genetic variants associated with each fitness phenotype, identifying monogenic associations with several conditions. We then defined Mtb phenotypic and genetic features associated with clinical outcomes. We find that a subclade of Mtb strains, defined by variants largely involved in fatty acid metabolic pathways, share a universal slow growth phenotype that is associated with cavitary disease, treatment failure and increased transmission potential in Vietnam. We also find that mutations in Rv1339 , a poorly characterized phosphodiesterase, also associate with slow growth in vitro and with treatment failure in patients. Implications of all the available evidence Phenogenomic profiling demonstrates that Mtb strains exhibit distinct growth characteristics under metabolic and antibiotic stress conditions. These fitness profiles can serve as intermediate traits for GWAS and association with clinical outcomes. Intermediate phenotyping allows us to examine potential processes by which bacterial strain differences contribute to clinical outcomes. Our study identifies clinical strains with slow growth phenotypes under in vitro models of antibiotic and host-like metabolic conditions that are associated with adverse clinical outcomes. It is possible that the bacterial intermediate phenotypes we identified are directly related to the mechanisms of these outcomes, or they may serve as markers for the causal yet unidentified bacterial determinants. Via the intermediate phenotyping, we also discovered a surprising diversity in Mtb responses to the new anti-mycobacterial drugs that target central metabolic processes, which will be important in considering roll-out of these new agents. Our study and others that have identified Mtb determinants of TB clinical and epidemiological phenotypes should inform efforts to improve diagnostics and drug regimen design.

Antibiotic tolerance in Mycobacterium tuberculosis leads to less effective bacterial killing, poor treatment responses and resistant emergence. There is limited understanding of antibiotic tolerance in clinical isolates of M. tuberculosis. Therefore, we investigated the rifampicin tolerance of M. tuberculosis isolates, with or without pre-existing isoniazid-resistance. In-vitro rifampicin survival fractions determined by minimum duration of killing assay in isoniazid susceptible (n=119) and resistant (n=84) M. tuberculosis isolates. Rifampicin tolerance was correlated with bacterial growth, rifampicin minimum inhibitory concentrations (MICs) and isoniazid-resistant mutations. The longitudinal isoniazid-resistant isolates were analyzed for rifampicin tolerance based on collection time from patients and associated emergence of genetic variants. The median duration of rifampicin exposure reducing the M. tuberculosis surviving fraction by 90% (minimum duration of killing-MDK90) increased from 1.23 (95%CI 1.11; 1.37) and 1.31 (95%CI 1.14; 1.48) to 2.55 (95%CI 2.04; 2.97) and 1.98 (95%CI 1.69; 2.56) days, for IS and IR respectively, during 15 to 60 days of incubation respectively. Increase in MDK90 time indicated the presence of fast and slow growing tolerant sub-populations. A range of 6 log10-fold survival fraction enabled classification of tolerance as low, medium or high and revealed isoniazid-resistance association with increased tolerance with faster growth (OR=2.68 for low vs. medium, OR=4.42 for low vs. high, P-trend=0.0003). The high tolerance in longitudinal isoniazid-resistant isolates was specific to those collected during rifampicin treatment in patients and associated with bacterial genetic microvariants. Our study identifies a range of rifampicin tolerance and reveals that isoniazid resistance is associated with higher tolerance with growth fitness. Furthermore, rifampicin treatment may select isoniazid-resistant isolate microvariants with higher rifampicin tolerance, with survival potential similar to multi-drug resistant isolates. These findings suggest that isoniazid-resistant tuberculosis needs to be evaluated for rifampicin tolerance or needs further improvement in treatment regimen.

ABSTRACT Listeria monocytogenes is a foodborne bacterial pathogen that causes listeriosis. Positive regulatory factor A (PrfA) is a pleiotropic master activator of virulence genes of L. monocytogenes that becomes active upon the entry of the bacterium into the cytosol of infected cells. L. monocytogenes can survive and multiply at low temperatures; this is accomplished through the maintenance of appropriate membrane fluidity via branched-chain fatty acid (BCFA) synthesis. Branched-chain α-keto acid dehydrogenase (BKD), which is composed of four polypeptides encoded by lpd , bkdA1 , bkdA2 , and bkdB , is known to play a vital role in BCFA biosynthesis. Here, we constructed BKD-deficient Listeria strains by in-frame deletion of lpd , bkdA1 , bkdA2 , and bkdB genes. To determine the role in in vivo and in vitro , mouse model challenges, plaque assay in murine L2 fibroblast, and intracellular replication in J744A.1 macrophage were conducted. BKD-deficient strains exhibited defects in BCFA composition, virulence, and PrfA-regulon function within the host cells. Transcriptomics analysis revealed that the transcript level of the PrfA-regulon was lower in Δ bkdA1 strain than those in the wild-type. This study demonstrates that L. monocytogenes strains lacking BKD complex components were defective in PrfA-regulon function, and full activation of wild-type prfA may not occur within host cells in the absence of BKD. Further study will investigate the consequences of BKD deletion on PrfA function through altering BCFA catabolism. IMPORTANCE Listeria monocytogenes is the causative agent of listeriosis, a disease with a high mortality rate. In this study, we have shown that the deletion of BKD can impact the function of PrfA and the PrfA-regulon. The production of virulence proteins within host cells is necessary for L. monocytogenes to promote its intracellular survival and is likely dependent on membrane integrity. We thus report a link between L. monocytogenes membrane integrity and the function of PrfA. This knowledge will increase our understanding of L. monocytogenes pathogenesis, which may provide insight into the development of antimicrobial agents.

Background Central nervous system (CNS) infections are common causes of morbidity and mortality worldwide. Rapid, accurate identification of the likely cause is essential for clinical management and the early initiation of antimicrobial therapy, which potentially improves clinical outcome.Methods We applied liquid chromatography tandem mass-spectrometry on 45 cerebrospinal fluid (CSF) samples from a cohort of adults with/without CNS infections to discover potential diagnostic protein biomarkers. We then validated the diagnostic performance of a selected biomarker candidate in an independent cohort of 364 consecutively treated adults with CNS infections admitted to a referral hospital in southern Vietnam.Results In the discovery cohort, we identified lipocalin 2 (LCN2) as a potential biomarker of bacterial meningitis. The analysis of the validation cohort showed that LCN2 could discriminate bacterial meningitis from other CNS infections, including tuberculous meningitis, cryptococcal meningitis and viral/antibody-mediated encephalitis (sensitivity: 0.88 (95% confident interval (CI): 0.77–0.94), specificity: 0.91 (95%CI: 0.88–0.94) and diagnostic odd ratio: 73.8 (95%CI: 31.8–171.4)). LCN2 outperformed other CSF markers (leukocytes, glucose, protein and lactate) commonly used in routine care worldwide. The combination of LCN2 and these four routine CSF markers resulted in the highest diagnostic performance for bacterial meningitis (area under receiver-operating-characteristic-curve 0.96; 95%CI: 0.93–0.99).Conclusions Our results suggest that LCN2 is a sensitive and specific biomarker for discriminating bacterial meningitis from a broad spectrum of CNS infections. A prospective study is needed to further assess the diagnostic utility of LCN2 in the diagnosis and management of CNS infections.