Abstract Previously, we described a large collection of Drosophila strains that each carry an artificial exon containing a T2AGAL4 cassette inserted in an intron of a target gene based on CRISPR-mediated homologous recombination (Lee et al ., 2018). These alleles permit numerous applications and have proven to be very useful. Initially, the homologous recombination-based donor constructs had long homology arms (>500 bps) to promote precise integration of large constructs (>5kb). Recently, we showed that in vivo linearization of the donor constructs enables insertion of large artificial exons in introns using short homology arms (100-200 bps) (Kanca et al ., 2019a). Shorter homology arms make it feasible to commercially synthesize homology donors and minimize the cloning steps for donor construct generation. Unfortunately, about 50% of Drosophila genes lack suitable coding introns for integration of artificial exons. Here, we report the development of new set of constructs that allow the replacement of the coding region of genes that lack suitable introns with a KozakGAL4 cassette, generating a knock-out/knock-in allele that expresses GAL4 similarly as the targeted gene. We also developed custom vector backbones to further facilitate and improve transgenesis. Synthesis of homology donor constructs in custom plasmid backbones that contain the target gene sgRNA obviates the need to inject a separate sgRNA plasmid and significantly increases the transgenesis efficiency. These upgrades will enable the targeting of nearly every fly gene, regardless of exon-intron structure, with a 70-80% success rate.

Abstract Selecting hand actions to manipulate an object is affected both by perceptual factors and by action goals. Affordances are associated with the automatic potentiation of motor representations to an object, independent of the goal of the actor. In previous studies, we have demonstrated an influence of the congruency between hand and object orientations on response times when reaching to turn an object, such as a cup. In this study, we investigated how the representation of hand postures triggered by planning to turn a cup were influenced by this congruency effect, in an fMRI scanning environment. Healthy participants were asked to reach and turn a real cup that was placed in front of them either in an upright orientation or upside down. They were instructed to use a hand orientation that was either congruent or incongruent with the cup orientation. As expected, the motor responses were faster when the hand and cup orientations were congruent. There was increased activity in a network of brain regions involving object-directed actions during action planning, which included bilateral primary and extrastriate visual, medial and superior temporal areas, as well as superior parietal, primary motor and premotor areas in the left hemisphere. Specific activation of the dorsal premotor cortex (PMd) was associated with hand-object orientation congruency during planning, and prior to any action taking place. Activity in that area and its connectivity with the lateral occipito-temporal cortex (LOTC) increased when planning incongruent actions. The increased activity in premotor areas in trials where the orientation of the hand was incongruent to that of the object suggests a role in eliciting competing representations specified by hand postures in LOTC.

Abstract In most eukaryotic cells fatty acid synthesis occurs in the cytoplasm as well as in mitochondria. However, the relative contribution of mitochondrial fatty acid synthesis (mtFAS) to the cellular lipidome of metazoans is ill-defined. Hence, we studied the function of the fly Mitochondria enoyl CoA reductase (Mecr), the enzyme required for the last step of mtFAS. Loss of mecr causes lethality while neuronal loss leads to progressive neurological defects. We observe an elevated level of ceramides, a defect in Fe-S cluster biogenesis and increased iron levels in mecr mutants. Reducing the levels of either iron or ceramide suppresses the neurodegenerative phenotypes indicating that increased ceramides and iron metabolism are interrelated and play an important role in the pathogenesis. Mutations in human MECR cause pediatric-onset neurodegeneration and patient-derived fibroblasts display similar elevated ceramide levels and impaired iron homeostasis. In summary, this study shows an as-yet-unidentified role of mecr/MECR in ceramide and iron metabolism providing a mechanistic link between mtFAS and neurodegeneration.

Abstract The plight of insect populations around the world and the threats it poses to agriculture and ecosystems has thrown insecticide use into the spotlight. Spinosad is an organic insecticide, considered less harmful to beneficial insects than synthetic insecticides, but its mode of action remains unclear. Using Drosophila, we show that low doses of spinosad reduce cholinergic response in neurons by antagonizing Dα6 nAChRs. Dα6 nAChRs are transported to lysosomes that become enlarged and accumulate upon spinosad treatment. Oxidative stress is initiated in the central nervous system, and spreads to midgut and disturbs lipid storage in metabolic tissues in a Dα6-dependent manner. Spinosad toxicity was ameliorated with the antioxidant N-Acetylcysteine amide (NACA). Chronic exposures lead to mitochondrial defects, severe neurodegeneration and blindness in adult animals. The many deleterious effects of low doses of this insecticide reported here point to an urgent need for rigorous investigation of its impacts on beneficial insects.

Wnt signaling plays an essential role in developmental and regenerative myelination in the CNS. The Wnt signaling pathway is comprised of multiple regulatory layers; thus, how these processes are coordinated to orchestrate oligodendrocyte development remains unclear. Here we show CK2α, a Wnt/β-catenin signaling Ser/Thr kinase, phosphorylates Daam2, inhibiting its function and Wnt-activity during oligodendrocyte development. Intriguingly, we found Daam2 phosphorylation differentially impacts distinct stages of oligodendrocyte development, accelerating early differentiation followed by decelerating maturation and myelination. Application towards white matter injury revealed CK2α-mediated Daam2 phosphorylation plays a protective role for developmental and behavioral recovery after neonatal hypoxia, while promoting myelin repair following adult demyelination. Together, our findings identify a novel regulatory node in the Wnt pathway that regulates oligodendrocyte development via protein phosphorylation-induced signaling complex instability and highlights a new biological mechanism for myelin restoration.Wnt signaling plays a vital role in OL development and has been implicated as an adverse event for myelin repair after white matter injury. Emerging studies have shed light on multi-modal roles of Wnt effectors in the OL lineage, but the underlying molecular mechanisms and modifiable targets in OL remyelination remain unclear. Using genetic mouse development and injury model systems, we delineate a novel stage-specific function of Daam2 in Wnt signaling and OL development via a S704/T7-5 phosphorylation mechanism, and determine a new role of the kinase CK2α in contributing to OL development. In-depth understanding of CK2α-Daam2 pathway regulation will allow us to precisely modulate its activity in conjunction with Wnt signaling and harness its biology for white matter pathology.

The Interferon Regulatory Factor 2 Binding Protein Like (IRF2BPL) gene encodes a member of the IRF2BP family of transcriptional regulators. Currently the biological function of this gene is obscure, and the gene has not been associated with a Mendelian disease. Here we describe seven individuals affected with neurological symptoms who carry damaging heterozygous variants in IRF2BPL. Five cases carrying nonsense variants in IRF2BPL resulting in a premature stop codon display severe neurodevelopmental regression, hypotonia, progressive ataxia, seizures, and a lack of coordination. Two additional individuals, both with missense variants, display global developmental delay and seizures and a relatively milder phenotype than those with nonsense alleles. The bioinformatics signature for IRF2BPL based on population genomics is consistent with a gene that is intolerant to variation. We show that the IRF2BPL ortholog in the fruit fly, called pits (protein interacting with Ttk69 and Sin3A), is broadly expressed including the nervous system. Complete loss of pits is lethal early in development, whereas partial knock-down with RNA interference in neurons leads to neurodegeneration, revealing requirement for this gene in proper neuronal function and maintenance. The nonsense variants in IRF2BPL identified in patients behave as severe loss-of-function alleles in this model organism, while ectopic expression of the missense variants leads to a range of phenotypes. Taken together, IRF2BPL and pits are required in the nervous system in humans and flies, and their loss leads to a range of neurological phenotypes in both species.

Summary Naturally produced peptides (<100 amino acids) are important regulators of physiology, development, and metabolism. Recent studies have predicted that thousands of peptides may be translated from transcripts containing small open reading frames (smORFs). Here, we describe two peptides in Drosophila encoded by conserved smORFs, Sloth1 and Sloth2. These peptides are translated from the same bicistronic transcript and share sequence similarities, suggesting that they encode paralogs. Yet, Sloth1 and Sloth2 are not functionally redundant, and loss of either peptide causes animal lethality, reduced neuronal function, impaired mitochondrial function, and neurodegeneration. We provide evidence that Sloth1/2 are highly expressed in neurons, imported to mitochondria, and regulate mitochondrial complex III assembly. These results suggest that phenotypic analysis of smORF genes in Drosophila can provide a wealth of information on the biological functions of this poorly characterized class of genes.

Purkinje cells receive synaptic input from several classes of interneurons. Here, we address the roles of inhibitory molecular layer interneurons in establishing Purkinje cell function in vivo. Using conditional genetics approaches in mice, we compare how the lack of stellate cell versus basket cell GABAergic neurotransmission sculpts the firing properties of Purkinje cells. We take advantage of an inducible Ascl1CreER allele to spatially and temporally target the deletion of the vesicular GABA transporter, Vgat, in developing neurons. Selective depletion of basket cell GABAergic neurotransmission increases the frequency of Purkinje cell simple spike firing and decreases the frequency of complex spike firing in adult behaving mice. In contrast, lack of stellate cell communication increases the regularity of Purkinje cell simple spike firing while increasing the frequency of complex spike firing. Our data uncover complementary roles for molecular layer interneurons in shaping the rate and pattern of Purkinje cell activity in vivo.

Trichosporon is the dominant genus of epidermal fungi in giant pandas and causes local and deep infections. To provide the information needed for the diagnosis and treatment of trichosporosis in giant pandas, the sequence of ITS, D1/D2, and IGS1 loci in 29 isolates of Trichosporon spp which isolated from the body surface of giant pandas were combination to investigate interspecies identification and genotype. Morphological development was examined via slide culture. Additionally, mice were infected by skin inunction, intraperitoneal injection, and subcutaneous injection for evaluation of pathogenicity. The twenty-nine isolates of Trichosporon spp. were identified as belonging to 11 species, and Trichosporon jirovecii and T. asteroides were the commonest species. Four strains of T. laibachii and one strain of T. moniliiforme were found to be of novel genotypes, and T. jirovecii was identified to be genotype 1. T. asteroides had the same genotype which involved in disseminated trichosporosis. The morphological development processes of the Trichosporon spp. were clearly different, especially in the processes of single-spore development. Pathogenicity studies showed that 7 species damaged the liver and skin in mice, and their pathogenicity was stronger than other 4 species. T. asteroides had the strongest pathogenicity and might provoke invasive infection. The pathological characteristics of liver and skin infections caused by different Trichosporon spp. were similar. So it is necessary to identify the species of Trichosporon on the surface of giant panda. Combination of ITS, D1/D2, and IGS1 loci analysis, and morphological development process can effectively identify the genotype of Trichosporon spp.

We previously reported a CRISPR-mediated knock-in strategy into introns of Drosophila genes, generating an attP - FRT-SA-T2A-GAL4-polyA-3XP3-EGFP-FRT-attP transgenic library for multiple uses (Lee et al., 2018b). The method relied on double stranded DNA (dsDNA) homology donors with ~1 kb homology arms. Here, we describe three new simpler ways to edit genes in flies. We create single stranded DNA (ssDNA) donors using PCR and add 100 nt of homology on each side of an integration cassette, followed by enzymatic removal of one strand. Using this method, we generated GFP-tagged proteins that mark organelles in S2 cells. We then describe two dsDNA methods using cheap synthesized donors flanked by 100 nt homology arms and gRNA target sites cloned into a plasmid. Upon injection, donor DNA (1 to 5 kb) is released from the plasmid by Cas9. The cassette integrates efficiently and precisely in vivo . The approach is fast, cheap, and scalable.