ABSTRACT Cyclin M (CNNM1-4) proteins maintain cellular and body magnesium (Mg 2+ ) homeostasis. Using various biochemical approaches, we have identified members of the CNNM family as direct interacting partners of ADP-ribosylation factor-like protein 15 (ARL15), a small GTP-binding protein. ARL15 interacts with CNNMs at their carboxyl-terminal conserved cystathionine-β-synthase (CBS) domains. In silico modeling of the interaction using the reported structures of both CNNM2 and ARL15 supports that the small GTPase specifically binds the CBS1 domain. Immunocytochemical experiments demonstrate that CNNM2 and ARL15 co-localize in the kidney, with both proteins showing subcellular localization in the Golgi-apparatus. Most importantly, we found that ARL15 is required for forming complex N-glycosylation of CNNMs. Overexpression of ARL15 promotes complex N-glycosylation of CNNM3. Mg 2+ uptake experiments with a stable isotope demonstrate that there is a significant increase of 25 Mg 2+ uptake upon knockdown of ARL15 in multiple kidney cancer cell lines. Altogether, our results establish ARL15 as a novel negative regulator of Mg 2+ transport by promoting the complex N-glycosylation of CNNMs.

Abstract Increased understanding of the modulatory pathways controlling CD8 T cell responses has led to the formulation of successful checkpoint inhibitor-based immunotherapies against cancer. However, their effectiveness is limited to a few tumor types, motivating the search for novel combinatorial strategies. PTPN1 and PTPN2 are two homologous protein tyrosine phosphatases recently proposed as potent intracellular checkpoints. Furthermore, their catalytic domain is a propitious target for small-molecule pharmacological intervention. Herein we investigated the potential effects of conditional genetic deletion of either or both phosphatases in mouse CD8 T cells, one of the main effectors in cancer immunotherapy. Our results demonstrated that hemizygous deletion of PTPN1 in a PTPN2 deficient background heightens the enhanced effector phenotype already observed in PTPN2 defective CD8 T cells. This functional gain is mediated by an autocrine IL-10 positive feedback loop. Pharmacological inhibition with a PTPN1/2 small-molecule inhibitor yielded similar results, highlighting the importance of simultaneously inhibiting both phosphatases. Our study uncovers a novel mechanism by which the downregulation of PTPN1 and PTPN2 act as a powerful tool for potentiating CD8 cytotoxic responses.