Model building into experimental maps is a key element of structural biology, but can be both time consuming and error prone for low-resolution maps. Here we present Namdinator, an easy-to-use tool that enables the user to run a molecular dynamics flexible fitting simulation followed by real-space refinement in an automated manner through a pipeline system. Namdinator will modify an atomic model to fit within cryo-EM or crystallography density maps, and can be used advantageously for both the initial fitting of models, and for a geometrical optimization step to correct outliers, clashes and other model problems. We have benchmarked Namdinator against 39 deposited cryo-EM models and maps, and observe model improvements in 34 of these cases (87%). Clashes between atoms were reduced, and the model-to-map fit and overall model geometry were improved, in several cases substantially. We show that Namdinator is able to model large-scale conformational changes compared to the starting model. Namdinator is a fast and easy tool for structural model builders at all skill levels. Namdinator is available as a web service (https://namdinator.au.dk), or it can be run locally as a command-line tool.

Abstract Model building into experimental maps is a key element of structural biology, but can be both time consuming and error-prone. Here we present Namdinator, an easy-to-use tool that enables the user to run a Molecular Dynamics Flexible Fitting (MDFF) simulation in an automated manner through a pipeline system. Namdinator will modify an atomic model to fit within cryo-EM or crystallography density maps, and can be used advantageously for both the initial fitting of models, and for a geometrical optimization step to correct outliers, clashes and other model problems. We have benchmarked Namdinator against 39 deposited models and maps from cryo-EM and observe model improvements in 34 of these cases (87%). Clashes between atoms were reduced, and model-to-map fit and overall model geometry were improved, in several cases substantially. We show that Namdinator is able to model large scale conformational changes compared to the starting model. Namdinator is a fast and easy way to create suitable initial models for both cryo-EM and crystallography. It can fix model errors in the final steps of model building, and is usable for structural model builders at all skill levels. Namdinator is available as a web service ( https://namdinator.au.dk ), or can be run locally as a command-line tool. Synopsis A pipeline tool called Namdinator is presented that enables the user to run a Molecular Dynamics Flexible Fitting (MDFF) simulation in a fully automated manner, both online and locally. This provides a fast and easy way to create suitable initial models for both cryo-EM and crystallography and help fix errors in the final steps of model building.

Ionotropic glutamate receptors are ligand-gated ion channels governing neurotransmission in the central nervous system. Three major types of antagonists are known for the AMPA-type receptor GluA2: competitive, noncompetitive (i.e., negative allosteric modulators; NAMs) used for treatment of epilepsy, and uncompetitive antagonists. We here report a 4.65 Å resolution X-ray structure of GluA2, revealing that four molecules of the competitive antagonist ZK200775 and four molecules of the NAM GYKI53655 are capable of binding at the same time. Using negative stain electron microscopy, we show that GYKI53655 alone or ZK200775/GYKI53655 in combination predominantly results in compact receptor forms. The agonist AMPA provides a mixed population of compact and bulgy shapes of GluA2 not impacted by addition of GYKI53655. Taken together, this suggests that the two different mechanisms of antagonism that lead to channel closure are independent and that the distribution between bulgy and compact receptors primarily depends on the ligand bound in the glutamate binding site. DATABASE: The atomic coordinates and structure factors from the crystal structure determination have been deposited in the Protein Data Bank under accession code https://doi.org/10.2210/pdb6RUQ/pdb. The electron microscopy 3D reconstruction volumes have been deposited in EMDB (EMD-4875: Apo; EMD-4920: ZK200775/GYKI53655; EMD-4921: AMPA compact; EMD-4922: AMPA/GYKI53655 bulgy; EMD-4923: GYKI53655; EMD-4924: AMPA bulgy; EMD-4925: AMPA/GYKI53655 compact).

Abstract Ice-nucleation active (INA) bacteria can promote the growth of ice more effectively than any other known material. Utilizing specialized ice-nucleating proteins (INPros), they obtain nutrients from plants by inducing frost damage and, when airborne in the atmosphere, they drive ice nucleation within clouds and may affect global precipitation patterns. Despite their evident environmental importance, the molecular mechanisms behind INPro-induced freezing have remained largely elusive. In the present study, we investigated the folding and the structural basis for interactions between water and the ice-nucleating protein InaZ from the INA bacterium Pseudomonas syringae strain R10.79. Using vibrational sum-frequency generation and two-dimensional infrared spectroscopy, we demonstrate that the ice-active repeats of InaZ adopt a β-helical structure in solution and at water surfaces. In this configuration, hydrogen bonding between INPros and water molecules imposes structural ordering on the adjacent water network. The observed order of water increases as the interface is cooled to temperatures close to the melting point of water. Experimental SFG data combined with spectral calculations and molecular-dynamics simulations shows that the INPro reorients at lower temperatures. We suggest that the reorientation can enhance order-inducing water interactions and, thereby, the effectiveness of ice nucleation by InaZ.

ABSTRACT Microbially-produced ice nucleating proteins (INpro) are unique molecular structures with the highest known catalytic efficiency for ice formation. Their critical role in rain formation and frost damage of crops together with their diverse commercial applications warrant an in-depth under-standing of their inherent ice nucleation mechanism. We used the machine-learning based software Al-phaFold to develop the first ab initio structural model of a bacterial INpro which is a novel beta-helix structure consisting of repeated stacks of two beta strands connected by two sharp turns. Using the synchrotron radiation circular dichroism, we validated the β-strand content of the model. Combining functional studies of purified recombinant INpro, electron microscopy and modeling, we further demonstrate that the formation of dimers and higher-order oligomers is key to INpro activity. This work presents a major advance in understanding the molecular foundation for bacterial ice-nucleation activity and the basis for investigating the mechanistic role of INpro-induced ice formation in the atmosphere, and for commercial design and production of ice-nucleating particles for industrial applications.

Plants adapt to fluctuating environmental conditions by adjusting their metabolism and gene expression to maintain fitness

Microfossils from the Paleoarchean Eon are the oldest known evidence of life. Despite their significance in understanding the history of life on Earth, any interpretation of the nature of these microfossils has been a point of contention among researchers. Decades of back-and-forth arguments led to the consensus that reconstructing the lifecycles of Archaean Eon organisms is the only way of understanding the nature of these microfossils. Here, we transformed a Gram-positive bacterium into a primitive lipid vesicle-like state and studied it under environmental conditions prevalent on early Earth. Using this approach, we successfully reconstructed morphologies and life cycles of Archaean microfossils. In addition to reproducing microfossil morphologies, we conducted experiments that spanned years to understand the process of cell degradation and how Archaean cells could have undergone encrustation minerals (in this case, salt), leading to their preservation as fossilized organic carbon in the rock record. These degradation products strongly resemble fossiliferous features from Archaean rock formations. Our observations suggest that microfossils aged between 3.8 to 2.5Ga most likely were liposome-like protocells that have evolved physiological pathways of energy conservation but not the mechanisms to regulate their morphology. Based on these observations, we propose that morphology is not a reliable indicator of taxonomy in these microfossils.

Abstract Cable bacteria encompass at least two genera, and they are known to vary greatly in habitat preferences and filament thickness. We systematically investigated variations and similarities in cellular structures and electrical properties of different cable bacteria strains. Using SEM, TEM, STEM-EDX and ToF-SIMS, we characterized shared features of cable bacteria, such as inner and outer membranes, surface layer and cell junction architecture, as well as strain specific features, like the number and size of periplasmic conductive fibers (PCFs). Our data indicates that the PCFs are organized as loose stranded rope-like structures. With spatially resolved elemental analysis we detected nickel-containing co-factors within the PCF of cable bacteria strains in both genera suggesting a conserved conduction mechanism. Electrical conductivity of different cable bacteria strains showed a range of values covering three orders of magnitude indicating an unknown metabolic adaptation. Using cryogenic electron tomography we discovered multiple polar chemosensory arrays, abundant cytoplasmic inner membrane-attached vesicles (IMVs), polysomes and inner membrane invaginations that shed light on cable bacteria metabolism including complex motility control mechanisms, localized protein synthesis, and membrane remodeling. We propose that the IMVs discovered in this work are novel metabolic hubs closely connected to the unique conductive fiber structure of cable bacteria.

Abstract Chronic hepatitis B (CHB) is a global health care challenge and a major cause of liver disease. To find new therapeutic avenues with a potential to functionally cure chronic Hepatitis B virus (HBV) infection, we performed a focused screen of epigenetic modifiers to identify replication inhibitors. From this work we identified isonicotinic acid inhibitors of the histone lysine demethylase 5 (KDM5) with potent anti-HBV activity. To enhance the cellular permeability and liver accumulation of the most potent KDM5 inhibitor identified (GS-080) an ester prodrug was developed (GS-5801) that resulted in improved bioavailability and liver exposure as well as an increased H3K4me3:H3 ratio on chromatin. GS-5801 treatment of HBV-infected primary human hepatocytes inhibited HBV replication and antigen levels. Evaluation of GS-5801 antiviral activity in a humanized mouse model of HBV infection, however, did not result in antiviral efficacy, despite achieving pharmacodynamic levels of H3K4me3:H3 predicted to be efficacious from the in vitro model. Here we discuss potential reasons for the disconnect between in vitro and in vivo efficacy, which highlight the translational difficulties of epigenetic targets for viral diseases.

Biofilm-protected pathogenic