ABSTRACT Mutation in isocitrate dehydrogenase ( mIDH ) is a gain of function mutation resulting in the production of the oncometabolite, R-2-hydroxyglutarate, that inhibits DNA and histone demethylases. The resultant hypermethylation phenotype reprograms the glioma cells’ transcriptome and elicits profound effects on glioma immunity. We report that in mouse models and human gliomas, mIDH1 in the context of ATRX and TP53 inactivation results in global expansion of the granulocytic myeloid cells’ compartment. Single-cell RNA-sequencing coupled with mass cytometry analysis revealed that these granulocytes are mainly non-immunosuppressive neutrophils and pre-neutrophils; with a small fraction of polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells. The mechanism of mIDH1 mediated pre-neutrophils expansion involves epigenetic reprogramming which leads to enhanced expression of the granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). Blocking G-CSF restored the inhibitory potential of PMN-MDSCs and enhanced tumor progression. Thus, G-CSF induces remodeling of the inhibitory PMN-MDSCs in mIDH1 glioma rendering them non-immunosuppressive; and having significant therapeutic implications. SIGNIFICANCE mIDH1 is the most common mutation in gliomas associated with improved prognosis. Gliomas harboring mIDH1 , together with ATRX and TP53 inactivation, exhibit higher circulating levels of G-CSF, ensuing the recruitment and expansion of non-suppressive neutrophils, pre-neutrophils and small fraction of PMN-MDSCs to the TME leading to an immune permissive phenotype.

Abstract Mutant isocitrate-dehydrogenase-1 (IDH1-R132H; mIDH1) is a hallmark of adult gliomas. Lower grade mIDH1 gliomas are classified into two molecular subgroups: (i) 1p/19q co-deletion/TERT-promoter mutations or (ii) inactivating mutations in α-thalassemia/mental retardation syndrome X-linked ( ATRX ) and TP53. This work, relates to the gliomas’ subtype harboring mIDH1, TP53 and ATRX inactivation. IDH1-R132H is a gain-of-function mutation that converts α-ketoglutarate into 2-hydroxyglutarate (D-2HG). The role of D-2HG within the tumor microenvironment of mIDH1/mATRX/mTP53 gliomas remains unexplored. Inhibition of 2HG, when used as monotherapy or in combination with radiation and temozolomide (IR/TMZ), led to increased median survival (MS) of mIDH1 glioma bearing mice. Also, 2HG inhibition elicited anti-mIDH1 glioma immunological memory. In response to 2HG inhibition, PD-L1 expression levels on mIDH1-glioma cells increased to similar levels as observed in wild-type-IDH1 gliomas. Thus, we combined 2HG inhibition/IR/TMZ with anti-PDL1 immune checkpoint-blockade and observed complete tumor regression in 60% of mIDH1 glioma bearing mice. This combination strategy reduced T-cell exhaustion and favored the generation of memory CD8 + T-cells. Our findings demonstrate that metabolic reprogramming elicits anti-mIDH1 glioma immunity, leading to increased MS and immunological memory. Our preclinical data supports the testing of IDH-R132H inhibitors in combination with IR/TMZ and anti-PDL1 as targeted therapy for mIDH1/mATRX/mTP53 glioma patients. Brief Summary Inhibition of 2-Hydroxyglutrate in mutant-IDH1 glioma in the genetic context of ATRX and TP53 inactivation elicits metabolic-reprograming and anti-glioma immunity.

Abstract Despite decades of intense research, glioma remains a disease for which no adequate clinical treatment exists. Given the ongoing therapeutic failures of conventional treatment approaches, nanomedicine may offer alternative options because it can increase the bioavailability of drugs and alter their pharmacokinetics. Here, a new type of synthetic protein nanoparticles (SPNPs) is reported that allow for effective loading and controlled release of the potent cancer drug, paclitaxel (PTX) – a drug that so far has been unsuccessful in glioma treatment due to hydrophobicity, low solubility, and associated delivery challenges. SPNPs are prepared by electrohydrodynamic (EHD) jetting of dilute solutions of PTX‐loaded albumin made by high‐pressure homogenization. After EHD jetting, PTX SPNPs possess a dry diameter of 165 ± 44 nm, hydrated diameter of 297 ± 102 nm, and a zeta potential of −19 ± 8 mV in water. For the SPNP formulation with a total PTX loading of 9.4%, the loading efficiency is 94%, and controlled release of PTX is observed over two weeks (6% burst release). PTX SPNPs are more potent (68% lethality) than free PTX (45% lethality using 0.2% dimethyl sulfoxide). PTX SPNPs in combination with IR show a significant survival benefit in glioma‐bearing mouse models, avoid adverse liver toxicity, and maintain a normal brain architecture. Immunohistochemistry reveals a dramatic tumor size reduction including 40% long‐term survivors without discernible signs of tumor. Using flexibly engineered SPNPs, this work outlines an efficient strategy for the delivery of hydrophobic drugs that are otherwise notoriously hard to deliver.

Abstract Diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) is a highly aggressive brain tumor with rare survival beyond two years. This poor prognosis is largely due to the tumor’s highly infiltrative and invasive nature. Previous reports demonstrate upregulation of the transcription factor ID1 with H3K27M and ACVR1 mutations, but this has not been confirmed in human tumors or therapeutically targeted. We developed an in utero electroporation (IUE) murine H3K27M-driven tumor model, which demonstrates increased ID1 expression in H3K27M- and ACVR1 -mutated tumor cells. In human tumors, elevated ID1 expression is associated with H3K27M/ ACVR1 -mutation, brainstem location, and reduced survival. The ID1 promoter demonstrates a similar active epigenetic state in H3K27M tumor cells and murine prenatal hindbrain cells. In the developing human brain, ID1 is expressed highest in oligo/astrocyte-precursor cells (OAPCs). These ID1 + /SPARCL1 + cells share a transcriptional program with astrocyte-like (AC-like) DIPG cells, and demonstrate upregulation of gene sets involved with regulation of cell migration. Both genetic and pharmacologic [cannabidiol (CBD)] suppression of ID1 results in decreased DIPG cell invasion/migration in vitro and invasion/tumor growth in multiple in vivo models. CBD reduces proliferation through reactive oxygen species (ROS) production at low micromolar concentrations, which we found to be achievable in the murine brainstem. Further, pediatric high-grade glioma patients treated off-trial with CBD (n=15) demonstrate tumor ID1 reduction and improved overall survival compared to historical controls. Our study identifies that ID1 is upregulated in DIPG through reactivation of a developmental OAPC transcriptional state, and ID1-driven invasiveness of DIPG is therapeutically targetable with CBD. One Sentence Summary The transcription factor ID1 is upregulated in a subset of DIPG tumor cells, and ID1-driven invasiveness is therapeutically targetable with CBD.

Abstract Mutant isocitrate dehydrogenase 1 (mIDH1; IDH1 R132H ) exhibits a gain of function mutation enabling 2-hydroxyglutarate (2HG) production. 2HG inhibits DNA and histone demethylases, inducing epigenetic reprogramming and corresponding changes to the transcriptome. We previously demonstrated 2HG-mediated epigenetic reprogramming enhances DNA-damage response and confers radioresistance in mIDH1 gliomas harboring p53 and ATRX loss of function mutations. In this study, RNA-seq and ChIP-seq data revealed human and mouse mIDH1 glioma neurospheres have downregulated gene ontologies related to mitochondrial metabolism and upregulated autophagy. Further analysis revealed that the decreased mitochondrial metabolism was paralleled by a decrease in glycolysis, rendering autophagy as a source of energy in mIDH1 glioma cells. Analysis of autophagy pathways showed that mIDH1 glioma cells exhibited increased expression of pULK1-S555 and enhanced LC3 I/II conversion, indicating augmented autophagy activity. This dependence is reflected by increased sensitivity of mIDH1 glioma cells to autophagy inhibition. Blocking autophagy selectively impairs the growth of cultured mIDH1 glioma cells but not wild-type IDH1 (wtIDH1) glioma cells. Targeting autophagy by systemic administration of synthetic protein nanoparticles packaged with siRNA targeting Atg7 (SPNP-siRNA-Atg7) sensitized mIDH1 glioma cells to radiation-induced cell death, resulting in tumor regression, long-term survival, and immunological memory, when used in combination with IR. Our results indicate autophagy as a critical pathway for survival and maintenance of mIDH1 glioma cells, a strategy that has significant potential for future clinical translation. One Sentence Summary The inhibition of autophagy sensitizes mIDH1 glioma cells to radiation, thus creating a promising therapeutic strategy for mIDH1 glioma patients. Graphical abstract Our genetically engineered mIDH1 mouse glioma model harbors IDH1 R132H in the context of ATRX and TP53 knockdown. The production of 2-HG elicited an epigenetic reprogramming associated with a disruption in mitochondrial activity and an enhancement of autophagy in mIDH1 glioma cells. Autophagy is a mechanism involved in cell homeostasis related with cell survival under energetic stress and DNA damage protection. Autophagy has been associated with radio resistance. The inhibition of autophagy thus radio sensitizes mIDH1 glioma cells and enhances survival of mIDH1 glioma-bearing mice, representing a novel therapeutic target for this glioma subtype with potential applicability in combined clinical strategies.

Pediatric high-grade gliomas (pHGGs) are diffuse and highly aggressive CNS tumors which remain incurable, with a 5-year overall survival of less than 20%. Within glioma, mutations in the genes encoding the histones H3.1 and H3.3 have been discovered to be age-restricted and specific of pHGGs. This work focuses on the study of pHGGs harboring the H3.3-G34R mutation. H3.3-G34R tumors represent the 9-15% of pHGGs, are restricted to the cerebral hemispheres, and are found predominantly in the adolescent population (median 15.0 years). We have utilized a genetically engineered immunocompetent mouse model for this subtype of pHGG generated via the Sleeping Beauty-transposon system. The analysis of H3.3-G34R genetically engineered brain tumors by RNA-Sequencing and ChIP-Sequencing revealed alterations in the molecular landscape associated to H3.3-G34R expression. In particular, the expression of H3.3-G34R modifies the histone marks deposited at the regulatory elements of genes belonging to the JAK/STAT pathway, leading to an increased activation of this pathway. This histone G34R-mediated epigenetic modifications lead to changes in the tumor immune microenvironment of these tumors, towards an immune-permissive phenotype, making these gliomas susceptible to TK/Flt3L immune-stimulatory gene therapy. The application of this therapeutic approach increased median survival of H3.3-G34R tumor bearing animals, while stimulating the development of anti-tumor immune response and immunological memory. Our data suggests that the proposed immune-mediated gene therapy has potential for clinical translation for the treatment of patients harboring H3.3-G34R high grade gliomas.

SUMMARY Classification of gliomas as wild-type or mutant IDH1/2 tumors has profound clinical implications. However, how these two groups of gliomas progress, in a microenvironment-dependent manner, is still a pending question. Here we describe that the expression of Tau is epigenetically induced by mutant IDH1/2, whereas is almost absent from tumors with EGFR/PTEN mutations. Moreover, Tau (MAPT) expression is inversely correlated with overall survival in EGFR -amplified gliomas. Using orthotopic EGFR -related models, we have observed that Tau overexpression or microtubule stabilizers impair the mesenchymal transformation of glioma cells, with profound changes in tumor vasculature and a significant decrease in tumor burden. However, epithelial-to-mesenchymal transformed EGFR -mutant cells, acting as pericytes, induce neo-vasculogenesis and favor aggressive glioma growth, a process that is no longer sensitive to Tau. Altogether our data indicate that the genomic background controls glioma aggressiveness by modifying the vascular microenvironment. GRAPHICAL ABSTRACT

Abstract Histone deacetylases (HDACs) have a wide range of targets and can rewire both the chromatin and lipidome of cancer cells. In this study, we show that valproic acid (VPA), a brain penetrant anti-epileptic and histone deacetylase inhibitor, inhibits the growth of IDH1 mutant tumors in vivo and in vitro, with at least some selectivity over IDH1 wild type tumors. Surprisingly, genes upregulated by VPA showed no change in chromatin accessibility at the promoter, but there was a correlation between VPA downregulated genes and diminished promoter chromatin accessibility. VPA inhibited the transcription of lipogenic genes and these lipogenic genes showed significant decrease in promoter chromatin accessibility only in the IDH1 MT glioma cell lines tested. VPA targeted a key lipogenic gene, fatty acid synthase (FASN), via inhibition of the mTOR pathway and both VPA and a selective FASN inhibitor TVB-2640 rewired the lipidome and promoted apoptosis in an IDH1 MT but not in an IDH1 WT glioma cell line. We further find HDACs are involved in the regulation of lipogenic genes and in particular HDAC6 is important for regulation of FASN in IDH1 MT glioma. Finally, we show that FASN knockdown alone and VPA in combination with FASN knockdown significantly improved the survival of mice in a IDH1 MT primary orthotopic xenograft model in vivo. We conclude that targeting fatty acid metabolism through HDAC inhibition and/or FASN inhibition may be a novel therapeutic option in IDH1 mutant gliomas.

Abstract Mutant isocitrate dehydrogenase 1 (mIDH1) alters the epigenetic regulation of chromatin, leading to a hypermethylation phenotype in adult glioma. Establishment of glioma-specific methylation patterns by mIDH1 reprogramming drives oncogenic features of cancer metabolism, stemness and therapeutic resistance. This work focuses on identifying gene targets epigenetically dysregulated by mIDH1. Treatment of glioma cells with mIDH1 specific inhibitor AGI-5198, upregulated gene networks involved in replication stress. Specifically, we found that the expression of ZMYND8, a regulator of DNA damage response was decreased in three patient-derived glioma cell cultures (GCC) after treatment with AGI-5198. ZMYND8 functions as a chromatin reader to modulate enhancer activity and recruit DNA repair machinery. Knockdown of ZMYND8 expression sensitized mIDH1 GCCs to radiotherapy marked by decreased cellular viability. Following IR, mIDH1 glioma cells with ZMYND8 knockout (KO) exhibit significant phosphorylation of ATM and sustained γH2AX activation. ZMYND8 KO mIDH1 GCCs were further responsive to IR when treated with either BRD4 or HDAC inhibitors. The accumulation of DNA damage in ZMYND8 KO mIDH1 GCCs promoted the phosphorylation of cell cycle checkpoint proteins Chk1 and Chk2. In addition, the recruitment of ZMYND8 to sites of DNA damage has been shown to be PARP- dependent. PARP inhibition further enhanced the efficacy of radiotherapy in ZMYND8 KO mIDH1 glioma cells. These findings indicate the impact of ZMYND8 in the maintenance of genomic integrity and repair of IR-induced DNA damage in mIDH1 glioma. Translational Relevance: Our understanding of radioresistance mechanisms in patient-derived glioma cell cultures (GCC) that endogenously express mIDH1-R132H are limited. We have uncovered a novel gene target Zinc Finger MYND-Type Containing 8 (ZMYND8) that is downregulated following treatment of human mIDH1 GCCs with mIDH1 specific inhibitors. We demonstrate that suppression of ZMYND8 expression by shRNA knockdown or genetic knockout reduces the cellular viability of mIDH1 GCCs to ionizing radiation (IR). Our findings reveal an epigenetic vulnerability of mIDH1 GCCs to ZMYND8 knockout (KO) which results in impaired resolution of IR-induced DNA damage and induction of cell cycle arrest. Additionally, ZMYND8 KO mIDH1 GCCs display increased radiosensitivity to inhibition of epigenetic regulators BRD4, HDAC, and PARP which could be mediated by enhanced replicative stress.

Background High grade gliomas are aggressive and immunosuppressive brain tumors. Molecular mechanisms that regulate the inhibitory immune tumor microenvironment (TME) and glioma progression remain poorly understood. FYN tyrosine kinase is a downstream target of the oncogenic receptor tyrosine kinases pathway and is overexpressed in human gliomas. FYN’s role in vivo in glioma growth remains unknown. We investigated whether FYN regulates glioma initiation, growth and invasion.Methods We evaluated the role of FYN using genetically engineered mouse glioma models (GEMM). We also generated FYN knockdown stem cells to induce gliomas in immune-competent and immune-deficient mice (NSG, CD8−/−, CD4−/−). We analyzed molecular mechanism by RNA-Seq and bioinformatics analysis. Flow cytometry was used to characterize immune cellular infiltrates in the FYN knockdown glioma TME.Results We demonstrate that FYN knockdown in diverse immune-competent GEMMs of glioma reduced tumor progression and significantly increased survival. Gene ontologies (GOs) analysis of differentially expressed genes in wild type vs. FYN knockdown gliomas showed enrichment of GOs related to immune reactivity. However, in NSG, CD8−/− and CD4−/− immune-deficient mice, FYN knockdown gliomas failed to show differences in survival. These data suggest that the expression of FYN in glioma cells reduces anti-glioma immune activation. Examination of glioma immune infiltrates by flow-cytometry displayed reduction in the amount and activity of immune suppressive myeloid derived cells (MDSCs) in the FYN glioma TME.Conclusions Gliomas employ FYN mediated mechanisms to enhance immune-suppression and promote tumor progression. We propose that FYN inhibition within glioma cells could improve the efficacy of anti-glioma immunotherapies.Key points Inhibition of FYN tyrosine kinase in genetically engineered mouse glioma models delays tumor initiation and progression. The oncogenic effects of FYN in vivo are mediated by downregulation of anti-glioma immunity.Importance of the Study FYN is an effector of receptor tyrosine kinases (RTK) signaling in glioma. However, its role in vivo remains unknown. Our study demonstrates that FYN tyrosine kinase is a novel regulator of the anti-glioma immune response. We show that FYN inactivation suppresses glioma growth, increases survival, and enhances anti-tumor immune reactivity. Our findings suggest that suppressing the expression of FYN in glioma cells could provide a novel therapeutic target.