Abstract Microbial predators obtain energy from killing other living cells. In this study, we present compelling evidence demonstrating that widely distributed Streptomyces soil bacteria, typically not considered as predators, possess the ability to detect and prey on Saccharomyces cerevisiae . Using fluorescence microscopy, we observed that predation is initiated by physical contact between Streptomyces lavendulae YAKB-15 and yeast cells. Comparative transcriptomics data indicated that the interaction triggered the production of numerous lytic enzymes to digest all major components of the yeast cell wall. The production of various glucanases, mannosidases and chitinases was confirmed by proteomics and enzymatic activity measurements. In order to destabilise the yeast cell membrane and assimilate yeast, Streptomyces lavendulae YAKB-15 induced production of cell-associated antifungal polyenes, namely pentamycin and filipin III, and cholesterol oxidase ChoD. In response, yeast downregulated protein synthesis and attempted to enter a quiescence-like state. We show that yeast predation is a common phenomenon in Streptomyces , including well-characterized strains such as Streptomyces peucetius ATCC 27952, where the interaction led to production of 14-hydroxyisochainin. Finally, gene inactivation studies lead us to propose a multidirectional assault model harbouring numerous redundancies that are not dependant on any single individual factor. Our results provide insights into the ecological role of Streptomyces and highlight the utilization of predation as a mechanism to elicit the production of bioactive natural products for drug discovery. Significance Statement Soil is a rich environment for microbes, where they compete for space and resources. Streptomyces bacteria are well-known for their ability to synthesize natural products, particularly antibiotics, that are used in chemical defense against competing microbes. Here we show that Streptomyces are, in fact, predatory bacteria. Upon encountering yeast cells, Streptomyces initiate the production of numerous enzymes that digest the cell wall of yeast. In addition, the interaction triggers the production of natural products that destabilize the yeast cell membrane. Collectively these actions lead to the death of yeast cells and release of cellular building blocks that Streptomyces can use as nutrients. The work fundamentally shifts the paradigm of how Streptomyces are perceived within the soil microbiome ecosystem.

Abstract RNA polymerases (RNAPs) synthesize RNA from NTPs, whereas DNA polymerases synthesize DNA from 2’dNTPs. DNA polymerases select against NTPs by using steric gates to exclude the 2’ OH, but RNAPs have to employ alternative selection strategies. In single-subunit RNAPs, a conserved Tyr residue discriminates against 2’dNTPs, whereas selectivity mechanisms of multi-subunit RNAPs remain hitherto unknown. Here we show that a conserved Arg residue uses a two-pronged strategy to select against 2’dNTPs in multi-subunit RNAPs. The conserved Arg interacts with the 2’OH group to promote NTP binding, but selectively inhibits incorporation of 2’dNTPs by interacting with their 3’OH group to favor the catalytically-inert 2’-endo conformation of the deoxyribose moiety. This deformative action is an elegant example of an active selection against a substrate that is a substructure of the correct substrate. Our findings provide important insights into the evolutionary origins of biopolymers and the design of selective inhibitors of viral RNAPs.

The biosynthetic pathway of actinorhodin in Streptomyces coelicolor A3(2) has been studied for decades as a model system of type II polyketide biosynthesis. The actinorhodin biosynthetic gene cluster includes a gene, actVI-orfA, that encodes a protein that belongs to the nuclear transport factor-2-like (NTF-2-like) superfamily. The function of this ActVI-ORFA protein has been a long-standing question in this field. Several hypothetical functions, including pyran ring cyclase, enzyme complex stability enhancer, and gene transcription regulator, have been proposed for ActVI-ORFA in previous studies. However, although the recent structural analysis of ActVI-ORFA revealed a solvent-accessible cavity, the protein displayed structural differences to the well-characterized cyclase SnoaL and did not possess a DNA-binding domain. The obtained crystal structure facilitates an inspection of the previous hypotheses regarding the function of ActVI-ORFA. In the present study, we investigated the effects of a series of actVI-orfA test plasmids with different mutations in an established vector/host system. Time-course analysis of dynamic metabolism profiles demonstrated that ActVI-ORFA prevented formation of shunt metabolites and may have a metabolic flux directing function, which shepherds the flux of unstable intermediates towards actinorhodin. The expression studies resulted in the isolation and structure elucidation of two new shunt metabolites from the actinorhodin pathway. Next, we utilized computational modeling to probe the active site of ActVI-ORFA and confirmed the importance of residues R76 and H78 in the flux directing functionality by expression studies. This is the first time such a function has been observed for a member of NTF-2-like superfamily in Streptomyces secondary metabolism.

Abstract Actinomycetes are important producers of pharmaceuticals and industrial enzymes. However, wild type strains require laborious development prior to industrial usage. Here we present a generally applicable reporter-guided metabolic engineering tool based on random mutagenesis, selective pressure, and single-cell sorting. We developed fluorescence-activated cell sorting (FACS) methodology capable of reproducibly identifying high-performing individual cells from a mutant population directly from liquid cultures. Genome-mining based drug discovery is a promising source of bioactive compounds, which is complicated by the observation that target metabolic pathways may be silent under laboratory conditions. We demonstrate our technology for drug discovery by activating a silent mutaxanthene metabolic pathway in Amycolatopsis . We apply the method for industrial strain development and increase mutaxanthene yields 9-fold to 99 mg l −1 in a second round of mutant selection. Actinomycetes are an important source of catabolic enzymes, where product yields determine industrial viability. We demonstrate 5-fold yield improvement with an industrial cholesterol oxidase ChoD producer Streptomyces lavendulae to 20.4 U g −1 in three rounds. Strain development is traditionally followed by production medium optimization, which is a time-consuming multi-parameter problem that may require hard to source ingredients. Ultra-high throughput screening allowed us to circumvent medium optimization and we identified high ChoD yield production strains directly from mutant libraries grown under preset culture conditions. In summary, the ability to screen tens of millions of mutants in a single cell format offers broad applicability for metabolic engineering of actinomycetes for activation of silent metabolic pathways and to increase yields of proteins and natural products.

Abstract Streptomyces soil bacteria produce hundreds of anthracycline anticancer agents with a relatively conserved set of genes. This diversity depends on the rapid evolution of biosynthetic enzymes to acquire novel functionalities. Previous work has identified S -adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase-like proteins that catalyze either 4-O-methylation, 10-decarboxylation or 10-hydroxylation, with additional differences in substrate specificities. Here we focused on four protein regions to generate chimeric enzymes using sequences from four distinct subfamilies to elucidate their influence in catalysis. Combined with structural studies we managed to depict factors that influence gain-of-hydroxylation, loss-of-methylation and substrate selection. The engineering expanded the catalytic repertoire to include novel 9,10-elimination activity, and 4-O-methylation and 10-decarboxylation of unnatural substrates. The work provides an instructive account on how the rise of diversity of microbial natural products may occur through subtle changes in biosynthetic enzymes.