Combining analysis of host proteome and transcriptome perturbations induced by tumour virus proteins with ongoing genome-wide studies of cancer facilitates the prioritization of cancer genes. This systematic search for host targets of tumour viruses, using proteome and transcriptome analyses of viral proteins from mammalian DNA viruses with transforming or tumorigenic properties, provides an extensive catalogue of changes in genetic and protein expression that can be screened against genome-wide studies of cancer. The study focuses on human papillomavirus, Epstein–Barr virus, adenovirus and polyomavirus. The resulting list of transforming viral protein targets identifies causal genes within both somatic and Mendelian cancer-associated loci. Genotypic differences greatly influence susceptibility and resistance to disease. Understanding genotype–phenotype relationships requires that phenotypes be viewed as manifestations of network properties, rather than simply as the result of individual genomic variations1. Genome sequencing efforts have identified numerous germline mutations, and large numbers of somatic genomic alterations, associated with a predisposition to cancer2. However, it remains difficult to distinguish background, or ‘passenger’, cancer mutations from causal, or ‘driver’, mutations in these data sets. Human viruses intrinsically depend on their host cell during the course of infection and can elicit pathological phenotypes similar to those arising from mutations3. Here we test the hypothesis that genomic variations and tumour viruses may cause cancer through related mechanisms, by systematically examining host interactome and transcriptome network perturbations caused by DNA tumour virus proteins. The resulting integrated viral perturbation data reflects rewiring of the host cell networks, and highlights pathways, such as Notch signalling and apoptosis, that go awry in cancer. We show that systematic analyses of host targets of viral proteins can identify cancer genes with a success rate on a par with their identification through functional genomics and large-scale cataloguing of tumour mutations. Together, these complementary approaches increase the specificity of cancer gene identification. Combining systems-level studies of pathogen-encoded gene products with genomic approaches will facilitate the prioritization of cancer-causing driver genes to advance the understanding of the genetic basis of human cancer.

ABSTRACT The human papillomavirus (HPV) E7 oncoprotein is a primary driver of HPV-mediated carcinogenesis. The E7 proteins from diverse HPV bind to the host cellular non-receptor protein tyrosine phosphatase type 14 (PTPN14) and direct it for degradation through the activity of the E7-associated host E3 ubiquitin ligase UBR4. Herein we show that a highly conserved arginine residue in the C-terminal domain of diverse HPV E7 mediates interaction with PTPN14. We found that disruption of PTPN14 binding through mutation of the C-terminal arginine did not impact the ability of several high-risk HPV E7 proteins to bind and degrade the retinoblastoma tumor suppressor or activate E2F target gene expression. HPVs infect human keratinocytes and we previously reported that both PTPN14 degradation by HPV16 E7 and PTPN14 CRISPR knockout repress keratinocyte differentiation-related genes. Now we have found that blocking PTPN14 binding through mutation of the conserved C-terminal arginine rendered both HPV16 and HPV18 E7 unable to repress differentiation-related gene expression. We then confirmed that the HPV18 E7 variant that could not bind PTPN14 was also impaired in repressing differentiation when expressed from the complete HPV18 genome. Finally, we found that the ability of HPV18 E7 to extend the lifespan of primary human keratinocytes required PTPN14 binding. CRISPR/Cas9 knockout of PTPN14 rescued keratinocyte lifespan extension in the presence of the PTPN14 binding-deficient HPV18 E7 variant. These results support the model that PTPN14 degradation by high-risk HPV E7 leads to repression of differentiation and contributes to its carcinogenic activity. IMPORTANCE Human papillomavirus (HPV)-positive carcinomas account for nearly 5% of the global human cancer burden. The E7 oncoprotein is a primary driver of HPV-mediated carcinogenesis. HPV E7 binds and degrades the putative tumor suppressor, PTPN14. However, the impact of PTPN14 binding by E7 on cellular processes is not well defined. Here, we show that PTPN14 binding is mediated by a conserved C-terminal arginine residue of HPV E7 in vivo . Additionally, we found that PTPN14 binding contributes to the carcinogenic activity of HPV18 E7 (the second most abundant HPV type in cancers). Finally, we determined that PTPN14 binding by HPV16 E7 and HPV18 E7 represses keratinocyte differentiation. HPV-positive cancers are frequently poorly differentiated and the HPV life cycle is dependent upon the keratinocyte differentiation program. The finding that PTPN14 binding by HPV E7 impairs differentiation has significant implications for both HPV-mediated carcinogenesis and the HPV life cycle.

ABSTRACT Infections with β-genus HPVs cause hyperplastic cutaneous lesions. In individuals with the rare hereditary skin disease, epidermodysplasia verruciformis, such lesions can progress to cutaneous squamous cell carcinomas (cSCC). β-HPV infections may also underlie cSCC development in chronically immunosuppressed individuals. Despite their prevalence and disease association, these viruses are not as well studied as the cancer-associated high-risk α-genus HPVs. HPV-associated lesions are characterized by a marked expansion of dividing, basal-like, poorly differentiated viral cells that contain viral genomes. This reflects the ability of HPVs to inhibit epithelial cell differentiation which is likely driven by the need to establish and maintain long-term viral infections in basal-like epithelial cells. Remarkably, the β-HPVs accomplish this by targeting different cellular effectors than the α-genus HPVs. It was previously reported that the HPV8 E6 protein restrains epithelial cell differentiation by inhibiting Notch and TGF-β signaling. Here we report that the HPV8 E6 protein can subvert Hippo signaling by activating TEAD transcriptional programs that inhibit the expression of keratinocyte differentiation markers. Moreover, we determined that HPV8 E6 can interfere with gene expression programs triggered by Wnt signaling by binding to the β-catenin-associated transcriptional co-activator BCL9L and that this also serves to restrain the expression of epithelial differentiation markers. Hence the HPV8 E6 protein has evolved a remarkably large array of mechanisms to subvert the differentiation program of the infected epithelial cells. IMPORTANCE Human papillomaviruses (HPVs) infect basal epithelial cells and cause a dramatic expansion of basal-like, proliferative cells. This reflects the ability of papillomaviruses to delay keratinocyte differentiation thereby maintaining aspects of the basal cell identity of persistently infected cells. This may enable papillomaviruses to establish and maintain long-term infections in squamous epithelial tissues. Previous work has revealed that the ability of β-HPV8 E6 protein to inhibit NOTCH and TGF-β signaling importantly contributes to this activity. Here we present evidence that HPV8 E6 also subverts Hippo and Wnt signaling and that these activities also aid in restraining keratinocyte differentiation.

High-risk human papillomavirus (HPV) E7 proteins enable oncogenic transformation of HPV-infected cells by inactivating host cellular proteins. High-risk but not low-risk HPV E7 target PTPN14 for proteolytic degradation, suggesting that PTPN14 degradation may be related to their oncogenic activity. HPV infects human keratinocytes but the role of PTPN14 in keratinocytes and the consequences of PTPN14 degradation are unknown. Using an HPV16 E7 variant that can inactivate RB1 but cannot degrade PTPN14 we found that high-risk HPV E7-mediated PTPN14 degradation impairs keratinocyte differentiation. Deletion of PTPN14 from primary human keratinocytes decreased keratinocyte differentiation gene expression. Related to oncogenic transformation, both HPV16 E7-mediated PTPN14 degradation and PTPN14 deletion promoted keratinocyte survival following detachment from a substrate. PTPN14 degradation contributed to high-risk HPV E6/E7-mediated immortalization of primary keratinocytes and HPV-positive but not HPV-negative cancers exhibit a gene expression signature consistent with PTPN14 inactivation. We find that PTPN14 degradation impairs keratinocyte differentiation and propose that this contributes to high-risk HPV E7-mediated oncogenic activity independent of RB1 inactivation.

Abstract The species specificity of papillomaviruses has been a significant roadblock for performing in vivo pathogenesis studies in common model organisms. The Mus musculus papillomavirus type 1 (MmuPV1) causes cutaneous papillomas that can progress to squamous cell carcinomas in laboratory mice. The papillomavirus E6 and E7 genes encode proteins that establish and maintain a cellular milieu that allows for viral genome synthesis and viral progeny synthesis in growth-arrested, terminally differentiated keratinocytes. The E6 and E7 proteins provide this activity by binding to and functionally reprogramming key cellular regulatory proteins. The MmuPV1 E7 protein lacks the canonical LXCXE motif that mediates the binding of multiple viral oncoproteins to the cellular retinoblastoma tumor suppressor protein, RB1. Our proteomic experiments, however, revealed that MmuPV1 E7 still interacts specifically with RB1. We show that MmuPV1 E7 interacts through its C-terminus with the C-terminal domain of RB1. Binding of MmuPV1 E7 to RB1 did not cause significant activation of E2F-regulated cellular genes. MmuPV1 E7 expression was shown to be essential for papilloma formation. Experimental infection of mice with MmuPV1 virus expressing an E7 mutant that is defective for binding to RB1 caused delayed onset, lower incidence, and smaller sizes of papillomas. Our results demonstrate that the MmuPV1 E7 gene is essential and that targeting non-canonical activities of RB1, which are independent of RB1’s ability to modulate the expression of E2F-regulated genes, contribute to papillomavirus-mediated pathogenesis. Importance Papillomavirus infections cause a variety of epithelial hyperplastic lesions, warts. While most warts are benign, some papillomaviruses cause lesions that can progress to squamous cell carcinomas and approximately 5% of all human cancers are caused by human papillomavirus (HPV) infections. The papillomavirus E6 and E7 proteins are thought to function to reprogram host epithelial cells to enable viral genome replication in terminally differentiated, normally growth-arrested cells. E6 and E7 lack enzymatic activities and function by interacting and functionally altering host cell regulatory proteins. Many cellular proteins that can interact with E6 and E7 have been identified, but the biological relevance of these interactions for viral pathogenesis has not been determined. This is because papillomaviruses are species-specific and do not infect heterologous hosts. Here we use a recently established mouse papillomavirus (MmuPV1) model to investigate the role of the E7 protein in viral pathogenesis. We show that MmuPV1 E7 is necessary for papilloma formation. The retinoblastoma tumor suppressor protein (RB1) is targeted by many papillomaviral E7 proteins, including cancer-associated HPVs. We show that MmuPV1 E7 can bind RB1 and that infection with a mutant MmuPV1 virus that expresses an RB1 binding defective E7 mutant caused smaller and fewer papillomas that arise with delayed kinetics.