Abstract Combinatorial signaling is key to instruct context-dependent cell behaviors. During embryonic development, adult homeostasis and disease, Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) act as dimers to instruct specific cellular responses. BMP ligands can form both homo- or heterodimers; however, obtaining direct evidence of the endogenous localization and function of each form has proven challenging. Here, we make use of precise genome editing and direct protein manipulation via protein binders to dissect the existence and functional relevance of BMP homo- and heterodimers in the Drosophila wing imaginal disc. This approach revealed in situ the existence of Dpp (BMP2/4)/Gbb (BMP5/6/7/8) heterodimers. We found that Gbb, despite being produced by all the cells of the wing imaginal disc, is only secreted by the cells in which Dpp is expressed. Dpp and Gbb form a gradient of heterodimers whereas neither Dpp nor Gbb homodimers are evident under endogenous physiological conditions. We find that the formation of heterodimers is critical for obtaining optimal signaling and long-range BMP distribution in the developing wing. These results indicate that Dpp/Gbb heterodimers are the active signal required for epithelial patterning and growth.

The generation of knockins is fundamental to dissect biological systems. SEED/Harvest, a technology based on CRISPR-Cas9, offers a powerful approach for seamless genome editing in Drosophila. Here, we present a protocol to tag any gene in the Drosophila genome using SEED/Harvest technology. We describe knockin design, plasmid preparation, injection, and insertion screening. We then detail procedures for germline harvesting. The technique combines straightforward cloning and robust screening of insertions, while still resulting in scarless gene editing. For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Aguilar et al.1

Abstract Precise genome engineering is essential for both basic and applied research. CRISPR/Cas accelerated the speed and ease by which defined exogenous sequences are integrated into specific loci. Nevertheless, knock-in generation in multicellular animals remains challenging, partially due to the complexity of insertion screening. Even when achieved, the analysis of protein localization can still be unfeasible in highly packed tissues, where spatial and temporal control of gene labeling would be ideal. Here, we describe SEED/Harvest, an efficient knock-in method based on homology-directed (HDR) and single-strand annealing (SSA) repair pathways. HDR mediates the integration of a switchable cassette. Upon a subsequent CRISPR-triggered repair event, resolved by SSA, the cassette is seamlessly removed. Germline excision of SEED cassettes allows for fast and robust knock-in generation with both fluorescent proteins and short protein tags in tandem. Tissue-specific expression of Cas9 results in somatic cassette excision, conferring spatio-temporal control of protein labelling and the conditional rescue of mutants. Finally, to achieve conditional protein labeling and manipulation of short tag knock-ins, we have developed a toolbox based on rational engineering and functionalization of the ALFA nanobody.

ABSTRACT Homeobox genes are prominent regulators of neuronal identity, but the extent to which their function has been probed in animal nervous systems remains limited. In the nematode Caenorhabditis elegans , each individual neuron class is defined by the expression of unique combinations of homeobox genes, prompting the question of whether each neuron class indeed requires a homeobox gene for its proper identity specification. We present here progress in addressing this question by extending previous mutant analysis of homeobox gene family members and describing multiple examples of homeobox gene function in different parts of the C. elegans nervous system. To probe homeobox function, we make use of a number of reporter gene tools, including a novel multicolor reporter transgene, NeuroPAL, which permits simultaneous monitoring of the execution of multiple differentiation programs throughout the entire nervous system. Using these tools, we add to the previous characterization of homeobox gene function by identifying neuronal differentiation defects for 12 homeobox genes in 20 distinct neuron classes that are mostly unrelated by location, function and lineage history. 10 of these 20 neuron classes had no homeobox gene function ascribed to them before, while in the other 10 neuron classes, we extend the combinatorial code of transcription factors required for specifying terminal differentiation programs. Furthermore, we demonstrate that in a particular lineage, homeotic identity transformations occur upon loss of a homeobox gene and we show that these transformations are the result of changes in homeobox codes. Combining the present with past analysis, 111 of the 118 neuron classes of C. elegans are now known to require a homeobox gene for proper execution of terminal differentiation programs. Such broad deployment indicates that homeobox function in neuronal identity specification may be an ancestral feature of animal nervous systems.

CRISPR-Cas greatly facilitated the integration of exogenous sequences into specific loci. However, knockin generation in multicellular animals remains challenging, partially due to the complexity of insertion screening. Here, we describe SEED/Harvest, a method to generate knockins in Drosophila, based on CRISPR-Cas and the single-strand annealing (SSA) repair pathway. In SEED (from "scarless editing by element deletion"), a switchable cassette is first integrated into the target locus. In a subsequent CRISPR-triggered repair event, resolved by SSA, the cassette is seamlessly removed. Germline excision of SEED cassettes allows for fast and robust knockin generation of both fluorescent proteins and short protein tags in tandem. Tissue-specific expression of Cas9 results in somatic cassette excision, conferring spatiotemporal control of protein labeling and the conditional rescue of mutants. Finally, to achieve conditional protein labeling and manipulation of short tag knockins, we developed a genetic toolbox by functionalizing the ALFA nanobody.

Abstract The conserved family of Hedgehog (Hh) signaling proteins plays a key role in cell-cell communication in development, tissue repair and cancer progression. These proteins can act as morphogens, inducing responses dependent on the ligand concentration in target cells located at a distance. Hh proteins are lipid modified and thereby have high affinity for membranes, which hinders the understanding of their spreading across tissues. Direct contact between cell membranes by filopodia-like structures (also known as cytonemes) could be the simplest explanation for Hh dispersal. To better understand this signaling mechanism, we have analyzed in Drosophila the interaction between the glypicans that, besides for other pathways, are necessary for Hh signaling, plus the adhesion molecules and Hh coreceptors Ihog and Boi. We describe that glypicans (Dally and Dally-like protein) are required to maintain Ihog, but not Boi, protein levels. We also show that ectopic Ihog stabilizes cytonemes through its interaction with glypicans, and we determine that two Ihog fibronectin III domains are essential for this interaction. Our data suggest that this interaction with Ihog in cytonemes confers the specificity of glypicans for Hh signaling.

Abstract The most downstream elements of the Hippo pathway, the TEAD transcription factors, are regulated by several cofactors, such as Vg/VGLL1-3. Earlier findings on human VGLL1 and here on human VGLL3 show that these proteins interact with TEAD via a conserved amino acid motif called the TONDU domain. Surprisingly, our studies reveal that the TEAD-binding domain of Drosophila Vg and of human VGLL2 is more complex and contains an additional structural element, an Ω-loop, that contributes to TEAD binding and in vivo function. To explain this unexpected structural difference between proteins from the same family, we propose that, after the genome-wide duplications at the origin of vertebrates, the Ω-loop present in an ancestral VGLL gene has been lost in some VGLL variants. These findings illustrate how structural and functional constraints can guide the evolution of transcriptional cofactors to preserve their ability to compete with other cofactors for binding to transcription factors.

Abstract The RNA binding motif 15 protein (RBM15) plays a critical role in post-transcriptional regulation. Its role in facilitating m6A modification, specifically through guiding the writer complex (WTAP METTL13 METTL14) to DRACH sequence motifs, has been demonstrated for several RNAs, including long noncoding RNAs (lncRNAs). The structural mechanism that underlies how RBM15 interacts with RNA has yet to be elucidated. In this study, we mined and bioinformatically assessed publicly available genome wide RNA 2D structural probing and RBP cross linking and immunoprecipitation data to investigate the propensity of lncRNAs to interact with RBM15. We then experimentally characterized how this interaction occurs with two lncRNAs, FIRRE and XIST. RBM15, which possesses three RNA recognition motifs (RRMs), primarily interacts with stem loop structures adopted by lncRNAs through its two terminal RRMs, RRMs 2 and 3. Using solution NMR, we find RRMs 2 and 3 are rigidly confined in solution, in the absence of RNA. Altogether, this work provides clarity on the molecular mechanism by which RBM15 interacts with RNAs to govern biological function.

Abstract Cellular development and specialized cellular functions are regulated processes which rely on highly dynamic molecular interactions among proteins, distributed in all cell compartments. Analysis of these interactions and their mechanisms of action has been one of the main topics in cellular and developmental research over the last fifty years. Studying and understanding the functions of proteins of interest (POIs) has been mostly achieved by their alteration at the genetic level and the analysis of the phenotypic changes generated by these alterations. Although genetic and reverse genetic technologies contributed to the vast majority of information and knowledge we have gathered so far, targeting specific interactions of POIs in a time- and space-controlled manner or analyzing the role of POIs in dynamic cellular processes such as cell migration or cell division would require more direct approaches. The recent development of specific protein binders, which can be expressed and function intracellularly, together with several improvements in synthetic biology techniques, have contributed to the creation of a new toolbox for direct protein manipulations. We selected a number of short tag epitopes for which protein binders from different scaffolds have been developed and tested whether these tags can be bound by the corresponding protein binders in living cells when they are inserted in a single copy in a POI. We indeed find that in all cases, a single copy of a short tag allows protein binding and manipulation. Using Drosophila , we also find that single short tags can be recognized and allow degradation and relocalization of POIs in vivo .

Abstract The establishment of tissue axes is fundamental during embryonic development. In the Drosophila wing, the anterior/posterior (AP) and the dorsal/ventral (DV) compartment boundaries provide the basic coordinates around which the tissue develops. These boundaries arise as a result of two lineage decisions, the acquisition of posterior fate by the selector gene engrailed ( en) and of dorsal fate by the selector gene apterous ( ap ). While en expression domain is set up during embryogenesis, ap expression only starts during early wing development. Thus, the correct establishment of ap expression pattern with respect to en must be tightly controlled. Here we have functionally investigated the transcriptional inputs integrated by the “early” ap enhancer (apE) and their requirement for correct boundary positioning. Detailed mutational analyses using CRISPR/Cas revealed a role of apE in positioning the DV boundary with respect to the AP boundary, with apE mutants often displaying mirror-image anterior wing duplications. We then accomplished tissue-specific enhancer disruption via dCas9 expression. This approach allowed us to dissect the spatio-temporal requirement of apE function, challenging the mechanism by which apE miss-regulation leads to AP defects. Base-pair resolution analyses of apE uncovered a single HOX binding site essential for wing development, which, when mutated, led to wingless flies. Along these lines, we found that the HOX gene Antennapedia (Antp) is fundamental for ap expression. In addition, we demonstrated that the transcription factors Pointed (Pnt), Homothorax (Hth) and Grain (Grn) are necessary for apE function. Together, our results provide a comprehensive molecular basis of early ap activation and the developmental consequences of its miss-regulation, shedding light on how compartmental boundaries are be set up during development.