Lipid droplets (LDs) are found in all cells and play critical roles in lipid metabolism. De novo LD biogenesis occurs in the endoplasmic reticulum (ER) but is not well understood. We imaged early stages of LD biogenesis using electron microscopy and found that nascent LDs form lens-like structures that are in the ER membrane, raising the question of how these nascent LDs bud from the ER as they grow. We found that a conserved family of proteins, fat storage-inducing transmembrane (FIT) proteins, is required for proper budding of LDs from the ER. Elimination or reduction of FIT proteins in yeast and higher eukaryotes causes LDs to remain in the ER membrane. Deletion of the single FIT protein in Caenorhabditis elegans is lethal, suggesting that LD budding is an essential process in this organism. Our findings indicated that FIT proteins are necessary to promote budding of nascent LDs from the ER.

Abstract Background Timothy syndrome (OMIM #601005) is a rare disease caused by variants in the gene CACNA1C . Initially, Timothy syndrome was characterized by a cardiac presentation of long QT syndrome and syndactyly of the fingers and/or toes, all associated with the CACNA1C variant, Gly406Arg. However, subsequent identification of diverse variants in CACNA1C has expanded the clinical spectrum, revealing various cardiac and extra-cardiac manifestations. It remains underexplored whether individuals with the canonical Gly406Arg variants in mutually exclusive exon 8A (Timothy syndrome 1) or exon 8 (Timothy syndrome 2) exhibit overlapping symptoms. Moreover, case reports have indicated that some CACNA1C variants may produce a cardiac-selective form of Timothy syndrome often referred to as non-syndromic long QT type 8 or cardiac-only Timothy syndrome, however few reports follow up on these patients to confirm the cardiac selectivity of the phenotype over time. Methods A survey was administered to the parents of patients with Timothy syndrome, querying a broad range of symptoms and clinical features. Study participants were organized into 5 separate categories based on genotype and initial diagnosis, enabling comparison between groups of patients which have been described differentially in the literature. Results Our findings reveal that Timothy syndrome patients commonly exhibit both cardiac and extra-cardiac features, with long QT syndrome, neurodevelopmental impairments, hypoglycemia, and respiratory issues being frequently reported. Notably, the incidence of these features was similar across all patient categories, including those diagnosed with non-syndromic long QT type 8, suggesting that the ‘non-syndromic’ classification may be incomplete. Conclusions This study represents the first Natural History Study of Timothy syndrome, offering a comprehensive overview of the disease’s clinical manifestations. We demonstrate that both cardiac and extra-cardiac features are prevalent across all patient groups, underscoring the syndromic nature of CACNA1C variants. While the critical role of long QT syndrome and cardiac arrhythmias in Timothy syndrome has been well recognized, our findings indicate that hypoglycemia and respiratory dysfunction also pose significant life-threatening risks, emphasizing the need for comprehensive therapeutic management of affected individuals.

Abstract Ciliary microtubules are subject to post-translational modifications that act as a “Tubulin Code” to regulate motor traffic, binding proteins and stability. In humans, loss of CCP1, a c ytosolic c arboxy p eptidase and tubulin deglutamylating enzyme, causes infantile-onset neurodegeneration. In C. elegans, mutations in ccpp-1 , the homolog of CCP1, result in progressive degeneration of neuronal cilia and loss of neuronal function. To identify genes that regulate microtubule glutamylation and ciliary integrity, we performed a forward genetic screen for suppressors of ciliary degeneration in ccpp-1 mutants. We isolated the ttll-5(my38) suppressor, a mutation in the t ubulin t yrosine l igase- l ike glutamylase gene. We show that mutation in ttll-4, ttll-5, or ttll-11 gene suppressed the hyperglutamylation-induced loss of microtubules and kinesin-2 mislocalization in ccpp-1 cilia. We also identified the nekl-4(my31) suppressor, an allele affecting the NIMA (Never in Mitosis A)-related kinase NEKL-4/NEK10. In humans, NEK10 mutation causes bronchiectasis, an airway and mucociliary transport disorder caused by defective motile cilia. C. elegans NEKL-4 does not localize to cilia yet plays a role in regulating axonemal microtubule stability. This work defines a pathway in which glutamylation, a component of the Tubulin Code, is written by TTLL-4, TTLL-5, and TTLL-11; is erased by CCPP-1; is read by ciliary kinesins; and its downstream effects are modulated by NEKL-4 activity. Identification of regulators of microtubule glutamylation in diverse cellular contexts is important to the development of effective therapies for disorders characterized by changes in microtubule glutamylation. By identifying C. elegans genes important for neuronal and ciliary stability, our work may inform research into human ciliopathies and neurodegenerative diseases.

ABSTRACT Genetic and environmental manipulations, such as dietary restriction (DR), can improve both health span and lifespan in a wide range of organisms, including humans. Changes in nutrient intake trigger often overlapping metabolic pathways that can generate distinct or even opposite outputs depending on several factors, such as when DR occurs in the lifecycle of the organism or the nature of the changes in nutrients. Due to the complexity of metabolic pathways and the diversity in outputs, the underlying mechanisms regulating diet-associated pro-longevity are not yet well understood. Adult reproductive diapause (ARD) in the model organism Caenorhabditis elegans is a DR model that is associated with lengthened lifespan and reproductive potential (Angelo and Van Gilst 2009). As the metabolic pathways regulating ARD have not yet been explored in depth, we performed a candidate-based genetic screen analyzing select nutrient-sensing pathways to determine their contribution to the regulation of ARD. Focusing on the three phases of ARD (initiation, maintenance, and recovery), we find that ARD initiation is regulated by fatty acid metabolism, sirtuins, AMPK, and the O-linked N-acetyl glucosamine (O-GlcNAc) pathway. Although ARD maintenance was not significantly influenced by the nutrient sensors in our screen, we found that ARD recovery was modulated by energy sensing, stress response, insulin-like signaling, and the TOR pathway. We also discovered that fatty acid β-oxidation regulates ARD initiation through a pathway involving the O-GlcNAc cycling enzyme, OGT-1, acting with the nuclear hormone receptor NHR-49. Consistent with these findings, our analysis revealed a change in levels of neutral lipids associated with ARD entry defects. Our findings thus identify novel conserved genetic pathways required for ARD entry and recovery and identify new genetic interactions that provide insight into the role of OGT and OGA.

Abstract Maintaining the metabolic homeostasis of fatty acids is crucial for human health. Excess fatty acids are stored in lipid droplets (LDs), the primary energy reservoir that helps regulate fat and lipid homeostasis in nearly all cell types. Seipin (BSCL2), a conserved endoplasmic reticulum protein, plays a critical role in LD biogenesis and regulating LD morphology. Pathogenic variants of seipin are associated with multiple human genetic diseases, including Berardinelli-Seip Congenital Generalized Lipodystrophy Type 2 (BSCL2). However, the cellular and molecular mechanisms by which dysfunctional seipin leads to these diseases remain unclear. To model BSCL2 disease, we generated an orthologous BSCL2 pathogenic variant seip-1(A185P) using CRISPR/Cas9 genome editing in Caenorhabditis elegans . This variant led to severe developmental and cellular defects, including embryonic lethality, impaired eggshell formation, and abnormally enlarged LDs. We set out to identify genetic determinants that could suppress these defective phenotypes in the seip-1(A185P) mutant background. To this end, we conducted an unbiased chemical mutagenesis screen to identify genetic suppressors that restore embryonic viability in the seip-1(A185P) mutant background. A total of five suppressor lines were isolated and recovered from the screen. The defective phenotypes of seip-1(A185P) , including embryonic lethality and impaired eggshell formation, were significantly suppressed in each suppressor line. Two of the five suppressor lines also alleviated the enlarged LDs in the oocytes. We then mapped a suppressor candidate gene, R05D3.2 (renamed as lmbr-1 ), which is an ortholog of human LMBR1 (limb development membrane protein 1). The CRISPR/Cas9 edited lmbr-1 suppressor alleles, lmbr-1(Ser647Phe) and lmbr-1(Pro314Leu) , both significantly suppressed embryonic lethality and defective eggshell formation in the seip-1(A185P) background. The newly identified suppressor lines offer valuable insights into potential genetic interactors and pathways that may regulate seipin in the lipodystrophy model.

Whole-genome sequencing provides a rapid and powerful method for identifying mutations on a global scale, and has spurred a renewed enthusiasm for classical genetic screens in model organisms. The most commonly characterized category of mutation consists of monogenic, recessive traits, due to their genetic tractability. Therefore, most of the mapping methods for mutation identification by whole-genome sequencing are directed toward alleles that fulfill those criteria (i.e., single-gene, homozygous variants). However, such approaches are not entirely suitable for the characterization of a variety of more challenging mutations, such as dominant and semi-dominant alleles or multigenic traits. Therefore, we have developed strategies for the identification of those classes of mutations, using polymorphism mapping in Caenorhabditis elegans as our model for validation. We also report an alternative approach for mutation identification from traditional recombinant crosses, and a solution to the technical challenge of sequencing sterile or terminally arrested strains where population size is limiting. The methods described herein extend the applicability of whole-genome sequencing to a broader spectrum of mutations, including classes that are difficult to map by traditional means.

SEIPIN, an ER membrane protein, plays critical roles in lipid droplet (LD) formation and lipid storage. Dysfunction of SEIPIN causes a variety of human diseases, including lipodystrophy, neuropathies, and male and female infertility. However, the cellular and molecular mechanisms of SEIPIN in causing these diseases are poorly understood. To address such mechanisms, we investigated the functional roles of R01B10.6 (seip-1) , the sole SEIPIN1 ortholog in C. elegans , using CRISPR/Cas9 gene editing, and transcriptional assays. SEIP-1::mScarlet is widely expressed throughout development in C. elegans . Three full gene deletion mutants, generated by CRISPR/Cas9, displayed penetrant embryonic lethality. EM imaging and the visualization of reporter genes revealed that the lipid-rich permeability barrier, the innermost layer of the C. elegans embryonic eggshell, was defective or missing. Intriguingly, depletion of SEIP-1 revealed a perturbed gene expression pattern for fatty acid biosynthesis enzymes, in agreement with the disrupted permeability barrier formation phenotype of the embryos. Lastly, dietary supplementation of PUFAs rescued the embryonic lethality and defective permeability barrier in the deletion mutants. In sum, our study suggests that SEIP-1 may maternally regulate LD biogenesis and maintain lipid homeostasis to orchestrate the formation of the lipid-rich permeability barrier, which is crucial for eggshell formation and embryogenesis.

The PIEZO proteins are involved in a wide range of developmental and physiological processes. Human PIEZO1 and PIEZO2 are newly identified excitatory mechano-sensitive proteins; they are non-selective ion channels that exhibit a preference for calcium in response to mechanical stimuli. To further understand the function of these proteins, we investigated the roles of pezo-1 , the sole PIEZO ortholog in C. elegans . pezo-1 is expressed throughout development in C. elegans , with strong expression in reproductive tissues. A number of deletion alleles as well as a putative gain-of-function mutant caused severe defects in reproduction. A reduced brood size was observed in the strains depleted of PEZO-1. In vivo observations show that oocytes undergo a variety of transit defects as they enter and exit the spermatheca during ovulation. Post ovulation oocytes were frequently damaged during spermathecal contraction. Calcium signaling in the spermatheca is normal during ovulation in pezo-1 mutants, however, pezo-1 interacts genetically with known regulators of calcium signaling. Lastly, loss of PEZO-1 caused defective sperm navigation after being pushed out of the spermatheca during ovulation. Mating with males rescued these reproductive deficiencies in our pezo-1 mutants. These findings suggest that PEZO-1 may act in different reproductive tissues to promote proper ovulation and fertilization in C. elegans .

Abstract The mechanosensitive PIEZO channel family has been linked to over 26 disorders and diseases. Although progress has been made in understanding these channels at the structural and functional levels, the underlying mechanisms of PIEZO-associated diseases remain elusive. In this study, we engineered four PIEZO-based disease models using CRISPR/Cas9 gene editing. We performed an unbiased chemical mutagen-based genetic suppressor screen to identify putative suppressors of a conserved gain-of-function variant pezo-1[R2405P] that in human PIEZO2 causes distal arthrogryposis type 5 (DA5; p. R2718P). Electrophysiological analyses indicate that pezo-1(R2405P) is a gain-of-function allele. Using genomic mapping and whole genome sequencing approaches, we identified a candidate suppressor allele in the C. elegans gene gex-3. This gene is an ortholog of human NCKAP1 (NCK-associated protein 1), a subunit of the Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP)-verprolin homologous protein (WAVE/SCAR) complex, which regulates F-actin polymerization. Depletion of gex-3 by RNAi, or with the suppressor allele gex-3(av259[L353F]) , significantly restored the small brood size and low ovulation rate, as well as alleviated the crushed oocyte phenotype of the pezo-1(R2405P) mutant. Auxin-inducible degradation of GEX-3 revealed that only somatic-specific degradation of GEX-3 restored the reduced brood size in the pezo-1(R2405P) mutants. Additionally, actin organization and orientation were disrupted and distorted in the pezo-1 mutants. Mutation of gex-3(L353F) partially alleviated these defects. The identification of gex-3 as a suppressor of the pathogenic variant pezo-1(R2405P) suggests that the cytoskeleton plays an important role in regulating PIEZO channel activity and provides insight into the molecular mechanisms of DA5 and other PIEZO-associated diseases.